<em> Ex Vivo</em> Colon органной культуры и ее использование в Антимикробная хост оборонных исследований
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
Кишечник отображает архитектуру повторяющихся крипт структур, состоящих из различных типов эпителиальных клеток, пластинкой propia, содержащих иммунные клетки, и стромы. Все эти гетерогенных клеток способствуют кишечной гомеостаза и участвуют в антимикробной защите хозяина. Таким образом, выявление суррогатной модели для изучения иммунного ответа и антимикробную активность кишечника в установке в пробирке является чрезвычайно сложной задачей. В пробирке исследования с использованием иммортализованных кишечника линии эпителиальных клеток или даже первичного крипту Органоид культуры не представляют точной физиологии нормального кишечника и его микросреды. Здесь мы обсудим метод культивирования мыши ткани толстой кишки в культуральную чашку и как это ех естественных условиях система органной культуры может быть реализован в исследованиях , связанных с антимикробным защитных реакций – хозяев. В типичных экспериментах мы показали, что колоны в органной культуре выражают антимикробные пептиды в соотвonse к экзогенного IL-1 и IL-18. Кроме того, противомикробные эффекторные молекулы , вырабатываемые ткани толстой кишки в органной культуре эффективно убить кишечной палочки в пробирке. Этот подход, таким образом, может быть использован, чтобы рассекать роль патогенез и опасности ассоциированных молекулярных моделей и их клеточных рецепторов в регуляции кишечной врожденные иммунные реакции и противомикробные реакции защиты организма.
Introduction
Кишечник представляет собой динамическую систему , которая действует в качестве барьера для синантропных микроорганизмов, борется с вторгшихся патогенов, а также регулирует микробного состава 1. Кишечные эпителиальные клетки, состоящие из энтероцитов, бокаловидных клеток, клеток Paneth и энтероэндокринные клеток, являются основными популяции клеток, которые обеспечивают защитные реакции организма против кишечных микробиоты. Кубком клетки производят муцины , которые создают демилитаризованную зону на верхней части эпителиального слоя 2. Клетки Paneth и энтероцитов производят антимикробные пептиды, цитокины и реактивные формы кислорода и азота , которые представляют собой противомикробные реакции защиты организма и способствует формированию кишечного микробного состава 3, 4. В дополнение к эпителиальным клеткам, клетки иммунной системы, включая макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы, естественные клетки-киллеры, лимфоциты, и Инны т.е лимфоидных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки и подслизистой играют решающую роль в кишечных антибактериальных реакций иммунной защиты путем продукции цитокинов, хемокинов и других посредников 5 – 7. Для того, чтобы понять, как иммунная система слизистых оболочек регулирует микрофлору и обеспечивает защиту от микробной инфекции, важно учитывать сложное взаимодействие гетерогенных клеточных популяций кишечнике. Тем не менее, модель в пробирке , которая включает в себя все особенности кишечника отсутствует. Таким образом, молекулярные исследования взаимодействия хозяин-патоген в кишечнике являются весьма сложной задачей.
За последние несколько лет, известно несколько модельных систем , которые имитируют аспекты слизистой оболочки кишечника, были разработаны для исследования патофизиологических процессов , участвующих в воспалительных заболеваний кишечника (IBD) и других желудочно – кишечных расстройств , 8 –= "Xref"> 14. Иммортализованные эпителиальным клеткам кишечника линии часто используются для изучения эпителиальные клетки конкретных ответов. Тем не менее, из – за дифференциальной экспрессии генов и функции в иммортализованных клеток, данные , полученные с использованием этих клеток не часто совпадают с наблюдаемыми в исследованиях in vivo на . Кишечные крипты Органоид культура в последнее время появились в качестве потенциального инструмента для оценки реакции эпителия кишечника на различные стимулы 13. В этой системе, крипт стволовые клетки могут расти и развивать 3D Органоид структуру. В то время как система Органоид культура очень полезна для изучения многих аспектов кишечного эпителия, он не имитирует сложное взаимодействие иммунных клеток, эпителиальных клеток и микробных продуктов. Экс Vivo культуры кишечной ткани предлагает лучшее представление в естественных условиях защитных реакций хозяина. В этом способе часть кишечника культивируют в пластинчатом остроумием клеточной культурыч надлежащие средства, позволяющие различные типы клеточных популяций в кишечнике, чтобы быть метаболически активными в течение по крайней мере 48 часов. Таким образом, экс виво культура органа может быть использован для измерения экспрессии генов антимикробных и ответов защиты хозяина кишечника к определенному стимулу.
Исследователи использовали экс виво систему органной культуры для изучения реакции иммунной защиты против микробной инфекции в кишечнике 15 – 21. Недавно мы приняли систему органной культуры для изучения роли инфламмасома в антимикробных защитных реакций хозяев в двоеточиями 22 мыши. Инфламмасома является молекулярная платформа для активации каспазы-1, который необходим для производства выдержанного IL-1 и IL-18. Мы показали , что IL-1β и IL-18 индуцирует антимикробные пептиды , которые эффективно уничтожают комменсальные pathobionts , таких как E.coli </em>. Это наблюдение согласуется с увеличением бремени кишечной палочки в инфламмасома исправный двоеточиями мыши 22. Эта система, следовательно, может быть использована для изучения роли распознающих рецепторов (РРСС) и других врожденных иммунных молекул в кишечных антибактериальных реакций иммунной защиты, а также патогенез кишечных расстройств, таких как воспалительное заболевание кишечника (IBD) и колоректального рака (КПР). Есть более чем 200 IBD восприимчивость генов, мутации и во многих из этих генов связаны с изменением микробного состава в кишечнике. Это имеет большое клиническое значение для определения точного механизма, с помощью которого гены IBD-восприимчивость регулировать кишечную флору. Общая цель этого метода является введение базовый протокол экс виво толстой кишки органной культуры и продемонстрировать , как этот метод культура может быть использован для изучения антимикробные реакции иммунной защиты кишечника.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кишечные эпителиальные клетки очень чувствительны с точки зрения их потребностей роста и, следовательно, трудно культуре. Эпителиальные клетки , выделенные при обработке ЭДТА , не выживают в обычных средах для культивирования клеток , таких как DMEM 8. Таким образом, исследов…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансирование от болезни Крона и колита фонда Америки, (CCFA, 3711) Профилактика рака и Научно-исследовательский институт Техаса (CPRIT; RP160169) и UT Southwestern Medical Center дано МГЦ
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
Riferimenti
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).
- Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota. Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).
- Wu, H. J., Wu, E. The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity. Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).
- Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).
- Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. Innate immunity in disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).
- Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. Intestinal epithelial cells in vitro. Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).
- Autrup, H. Explant culture of human colon. Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).
- Qin, J., et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 464, 59-65 (2010).
- Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut. 61, 961-962 (2012).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. 63, 1345-1354 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61, 1007-1015 (2012).
- Haque, A., et al. Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants. Gut. 53, 1424-1430 (2004).
- Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro. Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).
- Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies. Infect Immun. 44, 514-518 (1984).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J Anat. 134, 459-469 (1982).
- Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli. Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).
- Bareiss, P. M., et al. Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa. Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).
- Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants. J Vis Exp. , e4368 (2013).
- Hu, S., et al. The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense. Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).
- Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium. J Pathol. 180, 102-105 (1996).
- Dame, M. K., et al. Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).
- Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni. FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).
