그만큼<em> 전의 VIVO</em항균 호스트 방어 연구에> 콜론 오르간 문화와 그것의 사용
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
장 상피 세포의 종류, 점막 면역 세포를 포함 propia 및 간질로 이루어진 반복 토굴 구조체의 구조를 표시한다. 이러한 이종 세포 모두 장내 항상성에 기여 항균 호스트 방어에 참여한다. 따라서, 생체 외 환경에서 면역 반응과 소장의 항균 활성을 연구 대리 모델을 식별하는 것은 매우 어렵습니다. 시험관 연구에서 정상 소장과 미세 환경의 정확한 생리를 대변하지 않습니다 organoid 문화 불후의 장 상피 세포 라인 또는 기본 토굴을 사용. 여기서, 우리는 배양 접시와 어떻게 생체 기관 배양 물 시스템은 미생물 숙주 방어 반응에 관한 연구에서 구현 될 수있다에서 배양 마우스 결장암 조직의 방법을 논의한다. 대표 실험에서, 우리는 장기 문화에 콜론이 RESP에 항균 펩티드를 표현하는 것으로 나타났다외인성 IL-1β 및 IL-18 온세. 또한, 기관 배양 물에서의 결장 조직에 의해 생성 된 미생물 이펙터 분자가 효율적으로 시험 관내 대장균 죽인다. 이 방법은, 따라서, 장내 선천적 면역 반응과 미생물 숙주 방어 반응을 조절하는 pathogen- 및 위험 – 관련 분자 패턴 및 세포 수용체의 역할을 절개하는 데에 이용 될 수있다.
Introduction
소장은 공생 미생물에 대한 장벽 역할을하는 동적 시스템을 나타냅니다 침입하는 병원균에 대한 싸움, 그리고 미생물 조성물 1을 조절한다. 장 상피 세포, 장 세포, 술잔 세포 Paneth 세포 및 장 내분비 세포로 이루어진 장내 미생물 대 숙주 방어 반응을 제공하는 주요 세포 집단이다. 술잔 세포는 상피 층 (2)의 상단에 완충 영역을 작성 뮤신 생산. Paneth 세포 및 장 세포 항균 펩티드, 사이토 카인과 항균 숙주 방어 반응을 구성하고 장내 미생물 조성물 (3, 4)를 형성에 기여하는 활성 산소 및 질소 종을 생산한다. 상피 세포뿐만 아니라, 대 식세포, 수지상 세포, 호중구, 자연 살해 세포, 림프구 및 인나 포함한 면역 세포 – 7 점막 고유 층과 점막하에 테 림프 세포를 생산하는 사이토 카인, 케모카인, 기타 매개체 5 장 항균 호스트 방어 반응에 중요한 역할을한다. 점막 면역계는 미생물을 조절하고 미생물 감염에 대한 보호를 제공하는 방법을 이해하기 위해, 장내의 이종 세포 집단의 복잡한 상호 작용을 고려하는 것이 중요하다. 그러나, 소장의 기능을 모두 포함 체외 모델을 사용할 수 없습니다. 따라서, 소장에서 호스트 병원체 상호 작용에 대한 분자 연구는 매우 도전이다.
지난 몇 년 동안, 장 점막의 양상을 모방 여러 모델 시스템은 염증성 장 질환 (IBD) 등의 위장 장애 (8)과 관련된 병리 생리 학적 과정을 연구 개발되어왔다 –= "외부 참조"> 14. 불후의 장 상피 세포 라인은 종종 상피 세포의 특정 반응을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나, 차등 유전자 발현 및 불멸화 세포 기능, 데이터는 주로 생체 내 연구에서 관찰 된 것과 일치하지 않는 세포를 사용하여 얻은. 최근에 다른 자극 13 장 상피 세포의 반응을 평가하기위한 잠재적 인 도구로 떠오르고있다 organoid 문화 장 토굴. 이 시스템에서, 굴 줄기 세포 성장 및 3D organoid 구조를 개발할 수있다. organoid 배양 시스템은 장 상피 세포의 여러 측면을 연구하는데 매우 유용하지만, 면역 세포, 상피 세포 및 미생물 제품의 복잡한 상호 작용을 모방하지 않는다. 장 조직의 생체 문화는 생체 내 숙주 방어 반응을 더 잘 표현을 제공합니다. 이 방법에서, 상기 부위의 일부는 세포 배양 용 접시에서 배양 재치장내 세포 집단의 다른 유형을 허용 시간 적절한 미디어는 최소 48 시간 동안 대사 활성화합니다. 따라서, 장기의 생체 외 배양 미생물 유전자의 발현하고 특정 자극에 창자 숙주 방어 반응을 측정 할 수있다.
21 – 수사는 소장 (15)에 미생물 감염에 대한 숙주 방어 반응을 연구하기 위해 생체 장기 배양 시스템을 사용하고있다. 우리는 최근 마우스 콜론 (22)의 항균 호스트 방어 반응의 inflammasome을의 역할을 연구하기 위해 장기 배양 시스템을 채택했다. inflammasome을 성숙 IL-1β 및 IL-18의 생산을 위해 필요한 카스파 제 1의 활성화를위한 분자 플랫폼이다. 우리는 IL-1β 및 IL-18은 대장균 효과적으로 공생 pathobionts을 죽이는 항균 펩티드를 유도 것으로 나타났다 </em>. 이러한 관찰 inflammasome을 결손 마우스 결장 22 증가 대장균 부담과 일치했다. 이 시스템은 따라서, 그러한 염증성 장 질환 (IBD)과 결장암 (CRC)와 같은 장 질환의 장내 미생물 숙주 방어 반응에 패턴 인식 수용체 (PRRS)와 기타 선천성 면역 분자의 역할뿐만 아니라 기전을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 이들 유전자의 대부분이 장내에서 변형 된 미생물 조성과 관련된 200 개 이상의 IBD 감수성 유전자, 돌연변이가있다. 그것은 IBD – 감수성 유전자가 장내 미생물 규제되는 정확한 메커니즘을 결정하는 큰 임상 적 의의이다. 이 방법의 전반적인 목표는 생체 대장 기관 배양의 기본 프로토콜을 소개하고,이 배양 방법은 대장의 항균 호스트 방어 반응을 연구하는 데 사용할 수있는 방법을 설명하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
장 상피 세포 성장 요구 사항의 관점에서 매우 민감하고 문화에 따라서 어렵다. EDTA 처리에 의해 고립 된 상피 세포는 DMEM (8)과 같은 기존의 세포 배양 배지에서 생존하지 않습니다. 따라서, 고립 된 지하실 또는 기본 상피 세포를 사용하여 호스트 병원체 상호 작용 연구는 매우 도전이다. 최근, 사토 등. 장 병태 생리 (13)에 관한 연구에 매우 유망하고 유용한 토?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
암 예방 및 텍사스 연구소 (CPRIT, RP160169), 그리고 UT 사우스 웨스턴 의료 센터가 MHZ에게 주어진,이 작품은 크론과 미국의 대장염 재단 (3711 CCFA)에서 자금에 의해 지원되었다
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
Riferimenti
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).
- Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota. Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).
- Wu, H. J., Wu, E. The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity. Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).
- Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).
- Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. Innate immunity in disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).
- Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. Intestinal epithelial cells in vitro. Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).
- Autrup, H. Explant culture of human colon. Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).
- Qin, J., et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 464, 59-65 (2010).
- Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut. 61, 961-962 (2012).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. 63, 1345-1354 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61, 1007-1015 (2012).
- Haque, A., et al. Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants. Gut. 53, 1424-1430 (2004).
- Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro. Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).
- Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies. Infect Immun. 44, 514-518 (1984).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J Anat. 134, 459-469 (1982).
- Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli. Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).
- Bareiss, P. M., et al. Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa. Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).
- Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants. J Vis Exp. , e4368 (2013).
- Hu, S., et al. The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense. Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).
- Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium. J Pathol. 180, 102-105 (1996).
- Dame, M. K., et al. Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).
- Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni. FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).
