<em> Ex Vivo</emAntimikrobiyal Konak savunma Çalışmaları> Kolon Organ Kültür ve Kullanımı
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
bağırsak epitel hücrelerinin, farklı türde lamina bağışıklık hücrelerini ihtiva eden propia ve stroma oluşan tekrarlanan kript yapılarının bir mimariyi gösterir. Bu heterojen hücrelerin tüm intestinal homeostasis katkıda bulunmak ve antimikrobiyal konak savunmasında katılmak. Bu nedenle, in vitro ortamda bir bağışıklık yanıtı ve bağırsak antimikrobiyal aktivitesini incelemek için bir vekil örneğin belirlenmesi son derece zordur. In vitro çalışmalar, normal bağırsak ve mikroçevresinin tam fizyolojisini temsil etmemektedir organoid kültür ölümsüzleştirdi bağırsak epitel hücre hatları ya da birincil crypt kullanarak. Burada, bir kültür kabı ve bunun nasıl ex vivo organ kültürü sistemi antimikrobiyal konak savunma yanıtları ile ilgili çalışmalarda uygulanabilir kültürlemenin fare kolon dokusu için bir yöntem tartışılmaktadır. Örnek deneylerde, organ kültüründe kolonlar resp antimikrobiyal peptitleri ifade olduğunu göstermiştireksojen IL-1 ve IL-18'e Onse. Ayrıca, organ kültüründe kolon dokular tarafından üretilen antimikrobiyal efektör molekülleri verimli in vitro Escherichia coli öldürmek. Bu yaklaşım, bu nedenle, bağırsak doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını ve antimikrobiyal bir ev sahibi savunma tepkilerini düzenleyen patojen ve tehlike ilişkili moleküler desen ve hücresel reseptörlerin rol incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Bağırsak, ortakçı mikroorganizmalar için bir bariyer olarak görev yapan bir dinamik bir sistemi temsil eder, işgalci patojenlere karşı mücadele ve mikrobik bileşim 1 düzenler. bağırsak epitel hücreleri, enterositlerde, goblet hücreleri, Paneth hücreleri ve enteroendokrin hücrelerden oluşan, bağırsak mikrobıyota karşı konak savunma yanıtları sağlamak önemli hücre popülasyonları vardır. Goblet hücreleri epitel tabakası 2'nin üstünde bir askerden arındırılmış bölge oluşturmak müsinleri üretirler. Paneth hücreleri ve enterositler antimikrobiyal peptidler, sitokinler ve antimikrobiyal konak savunma yanıtları oluşturan ve bağırsak mikrobiyal kompozisyon 3, 4 şekillenmesine katkı reaktif oksijen ve nitrojen türlerinin üretirler. epitel hücrelerine ek olarak, makrofajlar, dendritik hücreler, nötrofiller, doğal katil hücreler, lenfositler ve Inna gibi immün hücrelerin 7 – lamina propria ve submukozada te lenfoid hücreler üreten sitokinler, kemokinler ve diğer arabulucular 5 bağırsak antimikrobiyal konak savunma yanıtları kritik bir rol oynamaktadır. mukozal bağışıklık sistemi Mikrobiyota düzenler ve mikrobik enfeksiyonlara karşı koruma sağlar anlamak amacıyla, gut heterojen hücre popülasyonu karmaşık etkileşimi dikkate alınması önemlidir. Bununla birlikte, bağırsak tüm özelliklerini kapsayan bir in vitro model için mevcut değildir. Bu nedenle, bağırsakta konak-patojen etkileşimi üzerinde moleküler çalışmalar son derece zordur.
Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, bağırsak mukozasının yönlerini taklit birkaç model sistemler enflamatuar barsak hastalıkları (IBD) ve diğer gastrointestinal bozukluklar 8 katılan patofizyolojik süreçlerin araştırılması için geliştirilmiştir –= "xref"> 14. Ölümsüzleştirilmiş intestinal epitelyal hücre hatları genellikle epitel hücre spesifik yanıtlar incelemek için kullanılır. Bununla birlikte, farklı gen ifadesi ve ölümsüzleştirilmiş hücre fonksiyon, veriler genellikle, in vivo çalışmalarda gözlenen ile eşleşmiyorsa, bu hücreler kullanılarak elde edilen. Son zamanlarda farklı uyaranlara 13 bağırsak epiteli yanıtını değerlendirmek için potansiyel bir araç olarak ortaya çıkmıştır organoid kültür bağırsak crypt. Bu sistemde, kript kök hücrelerin büyümesine ve 3D organoid yapısını geliştirmek için izin verilir. organoid kültür sistemi, bağırsak epiteli birçok açıdan çalışmak için çok yararlı olsa da, bağışıklık hücreleri, epitel hücreleri ve mikrobiyal ürünler kompleks bir etkileşim taklit etmez. Bağırsak dokusunun ex vivo kültür içinde in vivo konukçu savurma tepkilerin daha iyi bir temsilini sunar. Bu yöntemde, bağırsağın bir bölümü, bir hücre kültür plakası wit kültürlenirbağırsakta hücre popülasyonlarının farklı sağlayan h uygun ortam en az 48 saat süreyle metabolik olarak aktif olması için. Bu nedenle, organ, bir ex vivo kültür antimikrobiyal gen ekspresyonunu ve belirli bir uyarana bağırsak konak savunma tepkilerini ölçmek için kullanılabilir.
21 – Müfettişler bağırsakta 15 mikrobiyal enfeksiyonlara karşı konak savunma yanıtları incelemek için ex-vivo organ kültürü sistemi kullanılarak edilmiştir. Biz son zamanlarda fare iki nokta üst üste 22 antimikrobiyal konak savunma yanıtları inflammasome rolünü incelemek için organ kültürü sistemini benimsemiştir. inflammasome olgunlaşmış IL-1 p ve IL-18 üretimi için gerekli olan kaspaz-1 aktivasyonu için moleküler bir platformdur. Bu, IL-1β ve IL-18, E. coli gibi etkili bir ortakçı pathobionts öldürmek antimikrobiyal peptitler neden olduğunu gösterdi </em>. Bu gözlem, inflammasome kusurlu fare kolon 22 artmış, E. coli yükü ile tutarlıdır. Bu sistem, bu nedenle bu tür enflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD) ve kolorektal kanserin (CRC) gibi, bağırsak rahatsızlıklarının bağırsak antimikrobiyal konak savunma karşılıklarında eden örüntü tanıma reseptöleri (PRR'ler) ve diğer doğal bağışıklık moleküllerinin rolü ve hastalık oluşumunun incelenmesinde kullanılabilir. Bu genlerin çoğu bağırsağında değiştirilmiş mikrobiyal bileşim ile ilişkilidir 200'den IBD yatkınlık genleri ve mutasyon vardır. Bu IBD-yatkınlık genleri bağırsak Mikrobiyota düzenleyen hangi aracılığıyla hassas mekanizmasını belirlemek için büyük bir klinik öneme sahiptir. Bu yöntemin genel amacı, ex vivo kolon organ kültürü temel bir protokol tanıtmak ve bu kültür yöntemi bağırsak antimikrobiyal konak savunma yanıtları incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bağırsak epitelial hücreler büyüme şartları açısından çok hassas ve kültür nedenle zordur. EDTA muamelesi ile izole epitel hücreler, DMEM 8 gibi geleneksel hücre kültür ortamında hayatta yoktur. Bu nedenle, izole crypt veya birincil epitel hücreleri kullanılarak konak-patojen etkileşim çalışmaları çok zorlu. Son zamanlarda, Sato ve ark. Bağırsak patofizyolojisi 13 ile ilgili çalışmalar için çok umut verici ve yararlı bir crypt organoid kü…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü (CPRIT; RP160169) ve UT Güneybatı Tıp Merkezi MHZ verilen, bu çalışma Crohn ve Amerika Kolit Vakfı, (3711 CCFA) fon tarafından desteklenmiştir
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
Riferimenti
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).
- Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota. Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).
- Wu, H. J., Wu, E. The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity. Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).
- Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).
- Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. Innate immunity in disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).
- Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. Intestinal epithelial cells in vitro. Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).
- Autrup, H. Explant culture of human colon. Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).
- Qin, J., et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 464, 59-65 (2010).
- Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut. 61, 961-962 (2012).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. 63, 1345-1354 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61, 1007-1015 (2012).
- Haque, A., et al. Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants. Gut. 53, 1424-1430 (2004).
- Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro. Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).
- Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies. Infect Immun. 44, 514-518 (1984).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J Anat. 134, 459-469 (1982).
- Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli. Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).
- Bareiss, P. M., et al. Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa. Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).
- Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants. J Vis Exp. , e4368 (2013).
- Hu, S., et al. The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense. Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).
- Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium. J Pathol. 180, 102-105 (1996).
- Dame, M. K., et al. Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).
- Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni. FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).
