o<em> Ex Vivo</em> Órgão Cultura Colon e seu uso em Antimicrobial host Estudos de Defesa
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
O intestino tem uma arquitectura de estruturas cripta repetitivas que consistem em diferentes tipos de células epiteliais, lâmina própria contendo células do sistema imunológico, e estroma. Todas estas células heterogéneas contribuem para a homeostase intestinal e participar na defesa do hospedeiro antimicrobiana. Portanto, a identificação de um modelo substituto para estudar a resposta imune e atividade antimicrobiana do intestino em um ambiente in vitro é extremamente desafiador. Os estudos in vitro utilizando linhas de células epiteliais do intestino imortalizadas ou cripta mesmo primária organ�de cultura não representam a fisiologia exata do intestino normal e seu microambiente. Aqui, nós discutimos um método de cultura de tecido do cólon do rato numa placa de cultura e como este sistema de cultura ex vivo de órgãos pode ser implementado em estudos relacionados com as respostas de defesa do hospedeiro antimicrobianos. Em experiências representativas, que mostrou que dois pontos em cultura de órgão expressar peptídeos antimicrobianos em response de IL-1β e IL-18. Além disso, as moléculas efectoras antimicrobianos produzidos pelos tecidos do cólon em cultura de órgãos a matar eficientemente Escherichia coli in vitro. Esta abordagem, portanto, pode ser utilizada para dissecar o papel de padrões moleculares pathogen- e associada ao perigo e os seus receptores celulares na regulação de respostas imunes inatas intestinais e as respostas de defesa do hospedeiro antimicrobianos.
Introduction
O intestino representa um sistema dinâmico, que actua como uma barreira para os microrganismos comensais, luta contra os agentes patogénicos invasores, e regula a composição microbiana 1. As células epiteliais do intestino, que consiste em enterócitos, células caliciformes, células de Paneth e células enteroendócrinas, são as principais populações de células que fornecem respostas de defesa do hospedeiro contra a microbiota intestinal. As células caliciformes produzir mucinas que criam uma zona desmilitarizada na parte superior da camada epitelial 2. As células de Paneth e enterócitos produzem peptídeos antimicrobianos, citocinas e espécies de oxigênio e nitrogênio reativos que constituem respostas de defesa do hospedeiro antimicrobianos e contribuir para a definição da composição microbiana intestinal 3, 4. Em adição às células epiteliais, as células do sistema imunológico, incluindo macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, células assassinas naturais, os linfócitos e inna células linfóides te na lâmina própria e submucosa desempenhar um papel crítico na resposta de defesa do hospedeiro antimicrobianos intestinais pela produção de citocinas, quimiocinas e outros mediadores 5 – 7. A fim de compreender como o sistema imune da mucosa regula microbiota e fornece protecção contra a infecção microbiana, é importante considerar a interação complexa entre as populações de células heterogéneas do intestino. No entanto, um modelo in vitro que engloba todas as características do intestino não está disponível. Portanto, os estudos moleculares sobre a interação patógeno-hospedeiro no intestino são altamente desafiador.
Ao longo dos últimos anos, vários sistemas modelo que mimetizam aspectos da mucosa intestinal tem sido desenvolvido para investigar os processos patofisiológicos envolvidos em doenças inflamatórias do intestino (IBD) e outras desordens gastrointestinais 8 –= "xref"> 14. linhas de células epiteliais intestinais imortalizadas são muitas vezes usadas para estudar as respostas específicas de células epiteliais. No entanto, por causa da expressão diferencial de genes e função de células imortalizadas, os dados obtidos a partir de células usando esses muitas vezes não coincidir com os observados em estudos in vivo. Cripta intestinal organ�de cultura surgiu recentemente como um potencial instrumento para avaliar a resposta do epitélio intestinal a diferentes estímulos 13. Neste sistema, as células estaminais criptas são deixadas a crescer e a desenvolver uma estrutura organ�de 3D. Enquanto o sistema de cultura organ�de é muito útil para estudar muitos aspectos do epitélio intestinal, ele não imitam o complexo interacção de células do sistema imunológico, células epiteliais e produtos microbianos. A cultura ex vivo do tecido intestinal oferece uma melhor representação in vivo de respostas de defesa do hospedeiro. Neste método, uma parte do intestino é cultivada numa placa de cultura de células with meios adequados que permitem que os diferentes tipos de populações de células no intestino para ser metabolicamente activa durante pelo menos 48 h. Assim, uma cultura ex vivo do órgão pode ser utilizado para medir a expressão de genes antimicrobianos e as respostas de defesa do hospedeiro do intestino a um estímulo específico.
Os investigadores têm vindo a utilizar o sistema de cultura ex vivo de órgãos para estudar as respostas de defesa do hospedeiro contra a infecção microbiana no intestino 15-21. Nós recentemente adoptado o sistema de cultura de órgãos para estudar o papel da inflammasome nas respostas de defesa do hospedeiro antimicrobianos em dois pontos do rato 22. O inflamassoma é uma plataforma molecular para a activação de caspase-1, o que é necessário para a produção de IL-1β amadurecido e IL-18. Mostrámos que a IL-1β e IL-18 induzem péptidos antimicrobianos que matam eficazmente pathobionts comensais, tais como E. coli </em>. Esta observação foi consistente com aumento da carga E. coli em dois pontos do rato inflammasome defeituoso 22. Este sistema, por conseguinte, pode ser utilizado para estudar o papel de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) e outras moléculas imunitárias inatas em respostas de defesa do hospedeiro antimicrobianos intestinais, bem como patogénese de desordens intestinais, tais como doença inflamatória do intestino (IBD) e cancro colorrectal (CRC). Existem mais de 200 genes de susceptibilidade, IBD e mutações em muitos destes genes estão associados com a composição microbiana alterada no intestino. É de grande importância clínica para determinar o mecanismo preciso através do qual os genes de susceptibilidade IBD-regular a flora intestinal. O objectivo geral do presente método é a introdução de um protocolo básico de cultura de órgãos ex vivo do cólon e demonstrar como este método de cultura pode ser usado para estudar as respostas de defesa do hospedeiro antimicrobianos do intestino.
Protocol
Representative Results
Discussion
As células do epitélio intestinal são muito sensíveis em termos das suas necessidades de crescimento e, por conseguinte, difícil de cultura. As células epiteliais isoladas por tratamento com EDTA não sobrevivem no meio de cultura celular convencionais, tais como DMEM 8. Portanto, estudos de interação patógeno-hospedeiro usando cripta isolados ou células epiteliais primárias são muito desafiador. Recentemente, Sato et ai. descrito um sistema de cultura organ�de cripta, que é mui…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Fundação de Crohn e Colite da América, (CCFA; 3711) Prevenção de Câncer e Instituto de Pesquisa de Texas (CPRIT; RP160169) e UT Southwestern Medical Center dado a MHZ
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
Riferimenti
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).
- Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota. Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).
- Wu, H. J., Wu, E. The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity. Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).
- Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).
- Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. Innate immunity in disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).
- Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. Intestinal epithelial cells in vitro. Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).
- Autrup, H. Explant culture of human colon. Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).
- Qin, J., et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 464, 59-65 (2010).
- Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut. 61, 961-962 (2012).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. 63, 1345-1354 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61, 1007-1015 (2012).
- Haque, A., et al. Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants. Gut. 53, 1424-1430 (2004).
- Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro. Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).
- Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies. Infect Immun. 44, 514-518 (1984).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J Anat. 134, 459-469 (1982).
- Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli. Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).
- Bareiss, P. M., et al. Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa. Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).
- Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants. J Vis Exp. , e4368 (2013).
- Hu, S., et al. The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense. Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).
- Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium. J Pathol. 180, 102-105 (1996).
- Dame, M. K., et al. Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).
- Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni. FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).
