Ved hjelp av en Fluorescent PCR-kapillar-gelelektroforese teknikken for å genotype CRISPR / Cas9-mediert knockout-mutanter i en high-throughput-format

Summary

Den genotyping teknikken beskrevet her, som fluorescerende par polymerase-kjedereaksjon (PCR) for å kapillært gelelektroforese, gjør det mulig for high-throughput genotyping av nuklease-mediert knockout kloner. Det omgår begrensninger overfor andre genotype-teknikker og er mer kostnadseffektivt enn sekvenseringsmetoder.

Abstract

Utviklingen av programmerbare genom-redigeringsverktøy har muliggjort bruk av revers genetikk for å forstå de spesifikke roller genomiske sekvenser spiller i funksjon av celler og hele organismer. Denne årsaken har vært enormt hjulpet av den nylige lanseringen av CRISPR / Cas9 system et allsidig verktøy som lar forskere å manipulere genomet og transkriptomet for å blant annet slå ut, slå ned, eller slå på gener i en målrettet måte. I den hensikt å slå ut et gen, CRISPR / Cas9-medierte dobbel-strengbrudd rekruttere ikke-homologe ende-sammenføyning DNA reparasjon vei for å innføre den rammeskift-forårsaker insersjon eller delesjon av nukleotider ved pause stedet. Imidlertid kan en individuell veiledning RNA føre til uønskede off-target-effekter, og for å utelukke disse ut, er det nødvendig å bruke flere førings-RNA. Denne flerhet av mål betyr også at en høy-volum screening av kloner er nødvendig, som i sin tur ber bruk av en efkelig høy gjennomstrømming teknikk for å genotype knockout kloner. Nåværende teknikker for genotyping enten lider av iboende begrensninger eller medføre høye omkostninger, og dermed gjør dem uegnet for high-throughput formål. Her har vi detalj protokollen for å benytte fluorescens-PCR som anvender genomisk DNA fra rå cellelysat som en mal, og deretter løse de PCR-fragmentene via kapillar-gelelektroforese. Denne teknikken er nøyaktige nok til å skille ett basepar forskjell mellom fragmenter og derfor er tilfredsstillende i å indikere nærvær eller fravær av en rammeskift i den kodende sekvensen til den målsøkte gen. Dette presis kunnskap utelukker effektivt behovet for en bekreftende sekvense trinn, og tillater brukere å spare tid og kostnader i prosessen. Videre har denne teknikk vist seg å være allsidig i genotyping forskjellige pattedyr celler av forskjellige vev opprinnelse rettet av førings RNA mot tallrike gener, slik som vist her og andre steder.

Introduction

Omvendt genetiske metoder har tillatt forskere å belyse effekten av spesifikke endringer i genomet på cellen eller hele organismen. For eksempel kan ekspresjon av et bestemt gen svekkes ved hjelp av gen knockdown ^{1, 2} (delvis reduksjon) eller gen knockout ^{3, 4} (fullstendig ablasjon) for å bestemme den virkning dette har på funksjonen av cellen eller på utvikling av organismen.

Gene knockout eksperimenter har blitt lettere siden innføringen av sekvens-spesifikke programmerbare nukleaser, slik som zink-finger nukleaser (ZFNs) og transkripsjonsaktivator-lignende effektor-nuklease (Talens). Men den relativt nylige karakterisering av gruppert regelmessig ispedd korte palindromisk repeat (CRISPR) / Cas9 systemet har gjort det svært enkelt for alle laboratorie hele verden til å utføre gene knockout eksperimenter. I hovedsak CRISPR / Cas9 system består av to essensielle komponenter et enkelt hjelpe-RNA (sgRNA), som gjenkjenner og binder via base komplementaritet til en spesifikk sekvens i genomet, og en endonuklease som kalles Cas9. Den kjølvannet av den spesifikke binding, og virkningen av sgRNA-Cas9 kompleks på genom-DNA er den dobbelt-tråd spalting av DNA. Dette i sin tur utløser den DNA-skade svar mekanisme i cellen, som deretter reparert via de ikke-homologe ende-sammenføyning (NHEJ) eller homolog rekombinasjon (HR) veier. Siden NHEJ reparasjonsmekanismen (men ikke den HR-mekanisme) ofte resulterer i tilfeldig innskudd eller delesjon av nukleotider på stedet for reparasjon, noe som resulterer i innsetting / sletting (Indel) mutasjoner, kan det føre til at leserammen til et ekson å skifte. Dette kan da føre til at knockout av genet grunn av for tidlig avslutning av translasjon og nonsense-mediert nedbrytning ^{5, 6,7.}

Til tross for fordelene som oppnås ved innføringen av CRISPR / Cas9 system i å slå ut et gen, den genotyping av kloner av målsøkte celler er fortsatt en flaskehals, spesielt i en high-throughput innstilling ^{8, 9.} Eksisterende teknikker enten lider store iboende begrensninger eller er økonomisk kostbart. For eksempel, er den inspektør eller T7E1 analysen som er en enzymatisk analyse som detekterer feiltilpasninger i DNA-duplekser ^10, ikke i stand til å skille mellom villtype-kloner og homozygote mutanter (kloner som alleler er mutert identisk), ettersom disse kloner har identiske alleler og dermed presenterer ikke mistilpasninger i sin DNA-sekvens ^11. I tillegg er bruk av Sanger-sekvensering, som regnes som gullstandarden i genotyping mutantkloner, i en high-throughput oppsett uønsket på grunn av sin høye pris. Her presenterer vi en Detailed protokollen av den fluorescerende PCR-kapillar-gel-elektroforese teknikk som kan omgå begrensningene til de andre eksisterende genotyping teknikker, og er spesielt nyttig ved utførelse av en høy gjennomstrøming av nuklease-mediert knockout kloner. Denne metoden er teknisk enkel å utføre og sparer tid og kostnader.

Protocol

1. Innhenting CRISPR / Cas9 målrettede Single-celle kloner Seed HepG2-celler i en 6-brønn plate på 500.000 celler per brønn i 2 ml av antibiotika-fritt Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Inkuber i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Transfektere celler med plasmid samuttrykker Cas9 og spesifikk sgRNA mot genet som er av interesse ved bruk av et passende reagens transfeksjon i henhold til produsentens instruksjoner. NB: For eksempel s…

Representative Results

Det fluorescerende PCR-kapillar-elektroforese teknikk som er beskrevet her, er forventet å være anvendelig for et hvilket som helst kan målrettes region i genomet i praktisk talt en hvilken som helst cellelinje som er mottagelig for fremmed DNA levering. Vi har tidligere demonstrert dens anvendelse ved å målrette tre gener i en kolorektal kreft cellelinje 12. Her viser vi dens effekt i genotyping en leverkreft cellelinje, HepG2, målrettet med en CRISPR / Cas…

Discussion

Banke ut av et spesifikt gen i en modell cellelinje av valget har blitt rutine for å belyse rollen at genet spiller i den bestemte celle sammenheng. Faktisk er flere genomskjermer er for tiden tilgjengelig som bruker CRISPR / Cas9 system for å føre praktisk talt alle kjente humane gener i genomet ^{14, 15, 16.} Med disse store skjermer (eller til og med små-skala målretting av individuelle gener som er av interesse), er det v…

Materials

HEPG2 cells	ATCC	HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid	Addgene	PX458
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	15400054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
HyClone Water, Molecular Biology Grade	GE Healthcare	SH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Unlabeled PCR amplification forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Unlabeled PCR reverse primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core Kit	QIAGEN	201223
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard	Thermo Fisher Scientific	4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Thermo Fisher Scientific	4306737
3500xL Genetic Analyzer	Thermo Fisher Scientific	4405633
3500 Series 2 program	Thermo Fisher Scientific	4476988
Gene Mapper 5 program	Thermo Fisher Scientific	4475073
Gentra Puregene Cell Kit	QIAGEN	1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282
NAP1L1 Antibody (N-term)	Abgent	AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10]	GeneTex	GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	515-035-003