Med hjälp av en fluorescerande PCR-kapillärgelelektrofores Technique att genotypa CRISPR / Cas9-medierad Knockout mutanter i en hög kapacitet Format

Summary

Genotypning teknik som beskrivs här, vilken kopplar fluorescerande polymeraskedjereaktion (PCR) för att kapillär gelelektrofores, möjliggör hög genomströmning genotypning av nukleas-medierad knockout kloner. Det kringgår begränsningar av andra genotypning teknik möter och är mer kostnadseffektiv än sekvenseringsmetoder.

Abstract

Utvecklingen av programmerbara genomet-redigeringsverktyg har underlättat användningen av omvänd genetik för att förstå rollerna specifika genomsekvenser spelar i hur celler och hela organismer. Denna sak har oerhört hjälp av den nyligen införda av CRISPR / Cas9 system ett mångsidigt verktyg som gör det möjligt för forskare att manipulera genomet och transkriptom för att, bland annat, slå ut, riva eller slå in gener i en riktad sätt. För ändamålet att slå ut en gen, CRISPR / Cas9-förmedlad dubbel-strängbrott rekrytera icke-homolog-ändförening DNA-reparationsvägen för att införa den ramförskjutning som orsakar insättning eller deletion av nukleotider vid brottområdet. Dock kan en enskild styr RNA orsaka oönskade off-target effekter och att utesluta dessa ut, är det nödvändigt att använda flera styr RNA. Denna mångfald av mål innebär också att en hög volym screening av kloner krävs, vilket i sin tur väcker användningen av en efräckligt hög genomströmning teknik för att genotypa knockout kloner. Aktuella genotypning tekniker antingen lider av inneboende begränsningar eller ådra höga kostnader, därmed gör dem olämpliga för hög genomströmning ändamål. Här, vi detalj protokollet för användning av fluorescerande PCR, vilken använder genom-DNA från råa cellysat som en mall, och sedan lösa de PCR-fragmenten via kapillär gelelektrofores. Denna teknik är tillräckligt noggranna för att skilja en baspar skillnad mellan fragment och därmed är tillräcklig i indikerar närvaron eller frånvaron av en läsramsförskjutning i den kodande sekvensen av den målinriktade genen. Denna exakta kunskaper utesluter effektivt behovet av ett bekräftande sekvense steg och tillåter användare att spara tid och kostnader i processen. Dessutom har denna teknik visat sig vara mångsidig i genotypning olika däggdjursceller av olika vävnadsursprung riktade av styr RNA mot ett stort antal gener, såsom visas här och annorstädes.

Introduction

Omvända genetiska tillvägagångssätt har tillåtit forskare att belysa effekterna av specifika förändringar i genomet på cellen eller hela organismen. Till exempel, kan expressionen av en särskild gen dämpas genom gen knockdown ^{1, 2} (partiell reduktion) eller gen-knockout ^{3, 4} (fullständig ablation) för att bestämma den effekt som detta har på funktionen hos cellen eller på den utveckling av organismen.

Gen-knockout experiment har blivit lättare sedan införandet av sekvensspecifika programmerbara nukleaser, såsom zink-finger nukleaser (ZFNs) och transkriptionsaktivaliknande effektorceller nukleaser (Talens). Men den relativt nyligen karakterisering av klustrade regelbundet varvas korta palindrom repeat (CRISPR) / Cas9 systemet har gjort det mycket enkelt för laboratorie runt om i världen för att utföra gene knockoutexperiment. I huvudsak består den CRISPR / Cas9 system av två väsentliga komponenter-en enda styr RNA (sgRNA), som känner igen och binder via bas komplementaritet till en specifik sekvens i genomet, och ett endonukleas som kallas Cas9. Följderna av den specifika bindningen och verkan av sgRNA-Cas9 komplex på genomiskt DNA är den dubbelsträngklyvning av DNA. Detta i sin tur, utlöser DNA-skada svarsmekanism i cellen, som därefter repareras via de icke-homologa end-joining (NHEJ) eller homolog rekombination (HR) vägar. Eftersom reparationsmekanism NHEJ (men inte HR mekanism) resulterar ofta i den slumpmässiga insertion eller deletion av nukleotider vid platsen för reparation, vilket resulterar i insertion / deletion (InDel) mutationer, kan det orsaka läsramen för en exon att skifta. Detta kan då resultera i knockout av genen på grund av för tidig terminering av translation och nonsens-medierad sönderfall ^{5, 6,7.}

Trots bekvämligheten som erbjuds genom införandet av CRISPR / Cas9 systemet i att knacka ut en gen, genotypning av kloner av riktade celler förblir en flaskhals, särskilt i en hög genomströmning inställning ^{8, 9.} Existerande tekniker antingen drabbas stora inneboende begränsningar eller är ekonomiskt kostsamt. Till exempel, är inte i stånd att skilja mellan vildtyp kloner och homozygota mutanter lantmätaren eller T7E1 analys, vilket är en enzymatisk analys som detekterar felparningar i DNA-duplex ^10, (kloner vars alleler är muterade identiskt), eftersom dessa kloner har identiska alleler och således inte utgör felparningar i deras DNA-sekvens ^11. Dessutom är icke önskvärt att använda Sanger-sekvensering, som anses vara den gyllene standarden i genotypning mutanta kloner, i en hög genomströmning inställning på grund av dess höga kostnad. Här presenterar vi en Detailed protokoll av det fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores teknik, som kan kringgå begränsningarna hos andra befintliga genotypning tekniker och är särskilt användbar vid utförande av en hög genomströmning skärm av nukleas-medierad knockout kloner. Denna metod är tekniskt enkelt att utföra och sparar tid och kostnader.

Protocol

1. Erhållande CRISPR / Cas9-riktade Encelliga Kloner Utsäde HepG2-celler på en 6-brunnsplatta vid 500.000 celler per brunn i 2 ml antibiotikafritt Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). Inkubera i 24 h vid 37 ° C och 5% CO2. Transfektera celler med plasmid som samuttrycker Cas9 och specifik sgRNA mot genen av intresse med användning av ett lämpligt transfektionsreagens enligt tillverkarens instruktioner. OBS: Till exempel, sg…

Representative Results

Den fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores teknik som beskrivs här förväntas vara tillämpbar på varje inriktningsbar region i genomet i praktiskt taget vilken cellinje som är mottaglig för främmande DNA leverans. Vi har tidigare visat sin ansökan genom att rikta tre gener i en kolorektal cancer cellinje 12. Här visar vi dess effekt i genotypning av en hepatocellulär karcinom cellinje, HEPG2, riktad med en CRISPR / Cas9 konstruera mot nukleosomen A…

Discussion

Den slår ut av en specifik gen i en modell cellinje val har blivit rutin för att belysa den roll som genen spelar i det särskilda cellulära sammanhang. I själva verket flera genomvida skärmar är för närvarande tillgängliga som använder CRISPR / Cas9 system för att rikta praktiskt taget alla kända humana gener i genomet ^{14, 15, 16.} Med dessa stora skärmar (eller till och med småskalig inriktning av enskilda gener …

Materials

HEPG2 cells	ATCC	HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid	Addgene	PX458
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	15400054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
HyClone Water, Molecular Biology Grade	GE Healthcare	SH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Unlabeled PCR amplification forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Unlabeled PCR reverse primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core Kit	QIAGEN	201223
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard	Thermo Fisher Scientific	4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Thermo Fisher Scientific	4306737
3500xL Genetic Analyzer	Thermo Fisher Scientific	4405633
3500 Series 2 program	Thermo Fisher Scientific	4476988
Gene Mapper 5 program	Thermo Fisher Scientific	4475073
Gentra Puregene Cell Kit	QIAGEN	1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282
NAP1L1 Antibody (N-term)	Abgent	AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10]	GeneTex	GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	515-035-003