CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı
Summary
Floresan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) jel elektroforezi kılcal çiftler burada tarif edilen genotipleme tekniği, nükleaz aracılı nakavt klonları yüksek verimli genotipleme için izin verir. Diğer Genotipleme teknikleri karşılaştığı sınırlamaları ortadan ve dizileme yöntemleri maliyet açısından daha etkilidir.
Abstract
Programlanabilir genom düzenleme araçlarının geliştirilmesi spesifik genomik diziler hücreleri ve bütün organizmaların işlev görmesi de rol oynadıklarını anlamak için ters genetik kolaylaştırmıştır. Bu neden müthiş dızı CRISPR'nın yakın zamanda piyasaya sürülmüş araştırmacılar amacıyla, diğer şeylerin yanı sıra, genom ve transkriptom manipüle nakavt, yıkmak veya hedeflenen genlerinde vurmak için izin verir / Cas9 sistem çok yönlü bir araçtır ile yardım görmüştür tavır. bir gen nakavt amacıyla CRISPR / çift iplikli sonları kırılma yerinde nükleotidlerin çerçeve neden olan ekleme veya silme tanıtmak için homolog olmayan uç birleştirme DNA onarım yolağı işe Cas9 aracılı. Ancak, tek bir kılavuz RNA istenmeyen hedef dışı etkilere neden olabilir ve bu ekarte etmek için, çok sayıda kılavuz RNA'ların kullanılması gereklidir. hedeflerin bu çokluğu Klonlardan yüksek hacimli tarama bu da bir ef kullanımını begs olan, gerekli olduğu anlamına gelirnakavt klonları Genotip yüksek verimli tekniği ficient. Güncel genotip teknikleri ya dolayısıyla yüksek verimli amaçlar için uygunsuz render kalıcı sınırlamalar muzdarip veya yüksek ücrete tabidir. Burada, bir şablon olarak ham hücre lizatı, genomik DNA kullanan florasan PCR kullanılarak ve daha sonra, kılcal jel elektroforezi ile PCR parçası çözme ayrıntılarıyla protokolü. Bu teknik, fragmanlar arasında bir baz çift farklılığı ayırmak için yeterince doğru ve dolayısıyla hedeflenen genin kodlama dizisine bir çerçeve kayması varlığını veya yokluğunu gösteren de yeterlidir. Bu kesin bilgi etkin bir şekilde teyit dizisi aşaması için ihtiyaç engellemektedir ve kullanıcıların sürecinde zaman ve maliyetten tasarruf sağlar. Burada ve başka yerlerde gösterildiği gibi Ayrıca bu teknik, bir çok genin karşı kılavuz RNA'lar tarafından hedeflenen çeşitli doku kaynaklarından çeşitli memeli hücrelerini genotipleme içinde çok yönlü olduğu kanıtlanmıştır.
Introduction
Ters genetik yaklaşımlar bilim adamları hücrede veya bütün organizma üzerinde genomun spesifik değişikliklerle olası etkisini araştırmak için izin vermiş. Örneğin, belirli bir genin ekspresyonu, bu hücrenin veya fonksiyonu üzerinde sahip olduğu etkiyi tespit etmek amacıyla gen yok etme, 1, 2 (kısmi azalma) ya da gen nakavt 3, 4 (tamamen ortadan) zayıflatılmış edilebilir organizmanın gelişimi.
Gen knockout deneyleri, çinko-parmak nükleazlar (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) olarak dizi-spesifik programlanabilir nükleazlar, girmesinden bu yana kolay hale gelmiştir. Ancak, düzenli olarak kısa palindromik tekrarını (CRISPR) serpiştirildiği kümelenmiş nispeten son karakterizasyonu / Cas9 sistemi gen gerçekleştirmek için dünyanın herhangi bir laboratuvar için son derece kolay yapmıştırE nakavt deneyleri. Esas olarak, CRISPR / Cas9 sistemi iki temel bileşenleri-a tanır ve genomunda özel bir diziye baz tamamlayıcılık ile bağlanan tek bir kılavuz RNA (sgRNA), ve Cas9 adı verilen bir endonükleaz oluşur. genomik DNA üzerinde sgRNA-Cas9 kompleksinin spesifik bağlanma ve eylem sonrasında DNA çift iplikli bölünmesidir. Bu da, daha sonra, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ya da homolog rekombinasyon (HR) yolları ile tamir edilir hücre, DNA hasarı yanıt mekanizması devreye girer. NHEJ onarım mekanizması (ancak sıcak mekanizması) çoğu zaman ekleme / silme (indel) mutasyonlar ile sonuçlanan tamir yerinde rasgele yerleştirilmesi veya nükleotidin silinmesi ile sonuçlanmasından dolayı, bir eksonun okuma çerçevesi kaymasına neden olabilir. Bu, daha sonra, bağlı çeviri ve anlamsız aracılı çürüme 5, 6 'nın prematüre terminasyonuna genin nakavt sonuçlanabilir7.
Bir gen nakavt CRISPR / Cas9 sisteminin katılmasıyla elde kolaylık rağmen, hedeflenen hücre klonlarının genotipleme özellikle 8, 9 ayar yüksek throughput, bir tıkanıklık kalır. majör kendine özgü sınırları acı veya mali masraflı, ya Mevcut teknikleri. Örneğin, 10 dupleksleri DNA uyumsuzluklarını bulgulamaktadır enzimatik bir deneyidir bilirkişi veya T7E1 tahlili, vahşi tipli ve homozigoz mutantlar klonlar ayırt etmek mümkün değildir, bu klonlar, alele sahiptir ve dolayısıyla bu yana (olan aleller aynı mutasyona uğratılır klonları), DNA dizisi 11 uyumsuzlukları mevcut değildir. Buna ek olarak, yüksek verimli bir kurulumda, mutant klonları genotipleme altın standart olarak kabul edilir, Sanger sekanslanması, bir kullanımı, yüksek maliyet istenmemektedir. Burada, bir imhaya sunmakDiğer mevcut Genotipleme teknikleri limitlerini aşmak ve nükleaz aracılı nakavt klonlarının bir yüksek verimli bir ekranı yerine getirilmesinde özellikle faydalıdır floresan PCR kılcal jel elektroforezi tekniğinin ailed protokolü. Bu yöntem gerçekleştirmek için teknik olarak basit ve zaman ve maliyet tasarrufu sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
seçim modeli hücre hattında spesifik bir genin nakavt geni söz konusu hücresel bağlamda oynadığı rol ortaya çıkması için rutin hale gelmiştir. Aslında, çeşitli, genom çapında taramalarla genom 14, 15, 16, hemen hemen tüm bilinen insan dizilerini hedef CRISPR / Cas9 sistemi kullanmak şu anda mevcuttur. Bu büyük ölçekli ekranlar (veya ilgili tek tek genlerin hedeflenmesi daha küçük ölçekli) ile tasar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar kılcal jel elektroforezi deneyleri ile yardımcı olmak için Bayan Tan Shi Min, Bayan Helen Ong ve Dr Zhao Yi teşekkür etmek istiyorum. Bu iş / 1314/2011 NMRC ve Çevre Bakanlığı AcRF Tier 2 Fon hibe MOE2011-T2-1-051 hibe NMRC / IRG'de tarafından desteklendi.
Materials
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312 (2016).
- O’Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
- Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587 (2015).
- Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632 (2014).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157 (2014).
