Histologiska analyser av akut alkoholhaltig leverskada i sebrafisk
Summary
Detta protokoll beskriver histologiska analyser av lever från zebrafisklarver som har behandlats med 2% etanol i 24 timmar. Sådan akut etanolbehandling resulterar i leverstatos och svullnad i den hepatiska vaskulaturen.
Abstract
Alkoholhaltig leversjukdom (ALD) avser leverskador på grund av akut eller kronisk alkoholmissbruk. Det är bland de främsta orsakerna till alkoholrelaterad sjuklighet och dödlighet och drabbar mer än 2 miljoner människor i USA. En bättre förståelse för cell- och molekylära mekanismer som ligger till grund för alkoholframkallad leverskada är avgörande för att utveckla effektiv behandling för ALD. Sebrafisklarver uppvisar leverstatos och fibrogenes efter bara 24 timmars exponering för 2% etanol, vilket gör dem användbara för studier av akut alkoholhaltig leverskada. Detta arbete beskriver förfarandet för akut etanolbehandling i zebrafisklarver och visar att det orsakar steatos och svullnad i de leverblodkärlen. Ett detaljerat protokoll för hematoxylin och Eosin (H & E) färgning som är optimerad för den histologiska analysen av zebrafisk larvleveren beskrivs också. H & E-färgning har flera unika fördelar gentemot immunofluorescens, eftersom det markerar allt livCeller och extracellulära komponenter samtidigt och kan lätt detektera leverskada, såsom steatos och fibros. Med tanke på den ökande användningen av zebrafisk i modelleringstoxin och virusinducerad leverskada, såväl som ärftliga leversjukdomar, tjänar detta protokoll som referens för de histologiska analyserna som utförts i alla dessa studier.
Introduction
Alkoholhaltig leversjukdom (ALD), som orsakas av alkoholöverkonsumtion, är en viktig orsak till alkoholrelaterad sjuklighet och mortalitet. I USA innebär nästan hälften av leversjukdomsdöd alkohol 1 , och ALD ansvarar för nästan 1 av 3 levertransplantationer 2 . ALD har ett brett spektrum. Steatos, som kännetecknas av överflödig lipidackumulering i hepatocyter, förekommer i det tidiga skedet av tung dricks och är reversibel vid upphörande av alkoholanvändning. Under påverkan av genetiska och miljömässiga faktorer och fortsatt alkoholintag kan hepatisk steatos utvecklas till alkoholhepitit och slutligen cirros 3 . Studier som använder ALD-modellerna för gnagare har gett väsentliga insikter i sjukdomen, men de har begränsningar (ses i referens 3 ). Oral utfodring av en alkoholdiet orsakar bara steatos hos gnagare 4 , </ Sup> 5 . Utveckling av inflammation och fibros kräver antingen en andra förolämpning 6 , 7 eller kronisk intragastrisk infusion, vilket är invasiv och tekniskt utmanande 8 , 9 . Den teleosta zebrafisken utvecklar också leverskada som svar på både kronisk och akut alkoholbehandling 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . I synnerhet representerar larvalzebrafisken en attraktiv komplementärmodellorganisme för att studera akut alkoholhaltig leverskada 10 , 11 , 13 , 15 . Zebrafish lever är funktionell och producerar viktiga enzymer för etanol metabolism med 4 dagarS post-fertilization (dpf) 13 , 16 , 17. Ethanol kan direkt tillsättas till vattnet och exponering för 2% etanol i 24 timmar är tillräcklig för att inducera leverstatos och fibrogena svar i zebrafisklarver 13 , 15 .
Det har rapporterats att behandling med 2% etanol i 24 h resulterade i en vävnad etanolkoncentration av 80 mM i zebrafisklarver 13 . Andra har visat att larver tolererar denna koncentration och de leverfenotyper som ses i de behandlade djuren är specifika för etanolexponering 11 , 13 , 15 , 18 . Eftersom 80 mM är nästan dödligt hos människor 19 är det emellertid viktigt att utvärdera levern histologi hos den etanolbehandlade zebrafisken och detaRmine den fysiologiska relevansen för människor.
Den snabba externa utvecklingen och translucensen av zebrafisk larver gör det möjligt att karakterisera alkoholens verkan i levern i realtid och i fasta prover. Tillgängligheten av celltypsspecifika fluorescerande transgena linjer och de senaste framstegen inom konfokalmikroskopi underlättar studien av hur olika levercellsarter ändrar deras morfologi och beteende som svar på akut etanolbehandling 11 , 15 . Emellertid kan konfokal avbildning av den fluorescerande transgena zebrafisken inte helt ersätta hematoxylin och Eosin (H & E) -färgning vid studier av leverhistologi. Markering av alla levercellstyper samtidigt som transgena zebrafiskar kräver generering av individuella transgena linjer, var och en märkning av en levercellstyp med en unik fluorofor. Att introducera olika transgena bakgrunder i samma fisk kräver rasinG flera generationer, vilket är tidskrävande och dyrt. Ytterligare immunofluorescensfärgning behövs för att detektera extracellulära matriskomponenter. H & E-färgning, å andra sidan, märker samtidigt alla levercellstyper och extracellulära matriskomponenter, vilket ger en överblick över levern 20 . Dessutom avslöjar det lätt flera histopatologiska särdrag hos leversjukdomar, såsom hepatocytdöd, steatos och fibros. Fastän H & E är en rutinmässig fläck i däggdjursleverhistologi, används den inte vanligtvis i sebrafiskleverforskning, och protokollet är mindre väl etablerat.
I detta arbete beskrivs ett protokoll för akut etanolbehandling i zebrafisklarver och för uppföljning av histologiska analyser med H & E-färgning. H & E-färgningsprotokollet kan användas i alla studier av leverutveckling och funktion. Dessutom kan paraffinsektionerna användas för immunhistokemi såväl som för andra speciella staIns i leverpatologi, inkluderande trichrom-fläcken, reticulinfärgningen, etc.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det aktuella protokollet beskriver en detaljerad procedur för akut etanolbehandling i zebrafisklarver och de efterföljande histopatologiska analyserna med H & E-färgning. Akut etanolbehandling bör utföras vid tidpunkten 96 h efter befruktning, eftersom detta är det stadium då zebrafisklever börjar uttrycka alkoholmetaboliserande enzymer 13 . 2% etanol är den maximala dosen som larverna kan tolerera 13 , 14 . De etanolbehandla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna skulle vilja erkänna Dr Katy Murray vid Zebrafish International Resource Center; Dr Stacey Huppert och Kari Huppert på CCHMC, för deras användbara råd om protokollet; Och CCHMC veterinärservice, för fiskvården. Detta arbete stöddes av NIH-stipendiet R00AA020514 och ett forskningsbidrag från Center for Pediatric Genomics at CCHMC (to CY). Den var också delvis stödd av NIH-bidrag P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) i Cement Center för Digestive Disease Research Centre i Cincinnati.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
- Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. . Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , 2000-2011 (2014).
- Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
- Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
- Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
- Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
- Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
- Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
- Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
- Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
- Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
- Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
- Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
- Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
- Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
- Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
- Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
- Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
- Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
- Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
- Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).
