Histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis
Summary
Dit protocol beschrijft histologische analyses van de levers van zebravislarven die 24 uur met 2% ethanol zijn behandeld. Een dergelijke acute ethanolbehandeling resulteert in hepatische steatosis en zwelling van de hepatische vasculatuur.
Abstract
Alcoholische Leverziekte (ALD) verwijst naar schade aan de lever door acute of chronische alcoholmisbruik. Het is een van de belangrijkste oorzaken van alcoholgerelateerde morbiditeit en sterfte en treft meer dan 2 miljoen mensen in de Verenigde Staten. Een beter begrip van de cellulaire en moleculaire mechanismen die aan alcoholgeïnduceerde leverschade liggen, is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van een effectieve behandeling voor ALD. Zebravislarven vertoonden hepatische steatosis en fibrogenese na 24 uur blootstelling aan 2% ethanol, waardoor ze nuttig zijn voor de studie van acute alcoholische leverletsel. Dit werk beschrijft de procedure voor acute ethanolbehandeling bij zebravislarven en laat zien dat het leverkleuren en zwelling van de bloedvaten veroorzaakt. Een gedetailleerd protocol voor hematoxyline en Eosin (H & E) kleuring die is geoptimaliseerd voor de histologische analyse van de zebravis larve lever, wordt ook beschreven. H & E-kleuring heeft verschillende unieke voordelen ten opzichte van immunofluorescentie, aangezien het alle levens versterktCellen en extracellulaire componenten tegelijkertijd en kunnen gemakkelijk leverschade detecteren, zoals steatosis en fibrose. Gezien het toenemende gebruik van zebravis in modellerende toxine en door virus geïnduceerde leverletsel, evenals overgeërfde leverziekten, dient dit protocol als referentie voor de histologische analyses die in al deze studies zijn uitgevoerd.
Introduction
Alcoholische leverziekte (ALD), die wordt veroorzaakt door overconsumptie van alcohol, is een belangrijke oorzaak van alcoholgerelateerde morbiditeit en sterfte. In de Verenigde Staten betreffen bijna de helft van de leverziekte de alcohol 1 , en ALD is verantwoordelijk voor bijna 1 op 3 levertransplantaties 2 . ALD heeft een breed spectrum. Steatose, die wordt gekenmerkt door overmatige lipide accumulatie in hepatocyten, komt voor in het vroege stadium van zwaar drinken en is omkeerbaar bij stopzetting van alcoholgebruik. Onder invloed van genetische en omgevingsfactoren en voortdurende alcoholinname kan hepatische steatosis zich verder ontwikkelen tot alcoholische hepatitis en uiteindelijk cirrose 3 . Studies met behulp van ALD-modellen van knaagdieren hebben een aanzienlijke inzichten gegeven in de ziekte, maar ze hebben beperkingen (beoordeeld in referentie 3 ). Mondelinge voeding van een alcohol dieet veroorzaakt alleen steatosis bij knaagdieren 4 , </ Sup> 5 . Ontwikkeling van ontsteking en fibrose vereist een tweede belediging 6 , 7 of chronische intragastrische infusie, die invasieve en technisch uitdagend is 8 , 9 . De teleostzebravis ontwikkelt ook leverschade als reactie op zowel chronische als acute alcoholbehandeling 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . In het bijzonder vertegenwoordigt de larvezebravis een aantrekkelijk complementair modelorganisme waarin acute alcoholische leverletsel 10 , 11 , 13 , 15 wordt bestudeerd. De zebravis lever is functioneel en produceert belangrijke enzymen voor ethanol metabolisme met 4 dagenPost-fertilisatie (dpf) 13 , 16 , 17. Ethanol kan direct aan het water toegevoegd worden, en blootstelling aan 2% ethanol gedurende 24 uur is voldoende om hepatische steatosis en fibrogenische reacties in zebravis larven 13 , 15 te induceren.
Er is gemeld dat behandeling met 2% ethanol gedurende 24 uur resulteerde in een weefselethanolconcentratie van 80 mM in zebravis larven 13 . Anderen hebben aangetoond dat larven deze concentratie tolereren en de leverfenotypen die in de behandelde dieren zijn gezien, zijn specifiek voor de blootstelling aan ethanol 11 , 13 , 15 , 18 van ethanol. Echter, omdat 80 mM bijna dodelijk is bij mensen 19 , is het belangrijk om de leverhistologie van de met ethanol behandelde zebravis en dete te evalueren.De fysiologische relevantie voor de mens.
De snelle externe ontwikkeling en translucentie van zebravis larven maken het mogelijk om de werking van alcohol in de lever in real-time en in vaste monsters te karakteriseren. De beschikbaarheid van celltypespecifieke fluorescerende transgene lijnen en de recente vooruitgang in confocale microscopie vergemakkelijken de studie van hoe verschillende levercel-typen hun morfologie en gedrag veranderen in reactie op acute ethanolbehandeling 11 , 15 . Het confocale beeldvorming van de fluorescerende transgene zebravis kan echter niet volledig vervangen worden door hematoxyline en Eosin (H & E) kleuring bij het bestuderen van leverhistologie. Als u alle levercel types tegelijkertijd gebruikt met behulp van transgene zebravis, hoeft u alleen transgenische lijnen te genereren, die elk een leverceltype met een unieke fluorofoor labelen. Het introduceren van verschillende transgene achtergronden in dezelfde vis vereist rasG meerdere generaties, wat tijdrovend en kostbaar is. Extra immunofluorescentie kleuring is nodig om extracellulaire matrix componenten te detecteren. H & E-kleuring etikettert tegelijkertijd alle levercel-typen en extracellulaire matrixcomponenten, waardoor een overzicht van de lever 20 wordt gegeven . Bovendien onthult het verscheidene histopathologische kenmerken van leverziekten, zoals hepatocytestoornissen, steatosis en fibrose. Hoewel H & E een routinevlek is in zoogdierleverhistologie, wordt het niet vaak gebruikt bij leveronderzoek op zebravisvissen, en het protocol is minder goed gevestigd.
Dit werk beschrijft een protocol voor acute ethanolbehandeling bij zebravislarven en voor de follow-up histologische analyses met H & E-kleuring. Het H & E-kleurprotocol kan in alle studies van leverontwikkeling en -functie worden gebruikt. Bovendien kunnen de paraffine secties worden gebruikt voor immunohistochemie, evenals voor andere speciale staIns in leverpatologie, inclusief de trichroomvlek, reticuline vlek, enz .
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor acute ethanolbehandeling bij zebravislarven en de daaropvolgende histopathologische analyses met H & E-kleuring. Acute ethanolbehandeling moet niet eerder dan 96 uur na bevruchting worden uitgevoerd, aangezien dit het stadium is waarop de zebravislever alcohol-metaboliserende enzymen uitdrukt 13 . 2% ethanol is de maximale dosis die larven 13 , 14 kunnen tolereren. De m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zouden graag Dr. Katy Murray willen erkennen bij het Zebrafish International Resource Center; Dr. Stacey Huppert en Kari Huppert bij CCHMC, voor hun nuttige advies over het protocol; En CCHMC veterinaire dienst, voor de visverzorging. Dit werk werd ondersteund door NIH grant R00AA020514 en een onderzoeksbijdrage van het Center for Pediatric Genomics bij CCHMC (naar CY). Het was ook gedeeltelijk steun door NIH-subsidie P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) van het Spijsverteringskliniek Centrum in Cincinnati.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
- Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. . Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , 2000-2011 (2014).
- Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
- Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
- Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
- Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
- Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
- Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
- Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
- Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
- Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
- Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
- Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
- Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
- Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
- Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
- Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
- Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
- Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
- Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
- Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).
