Analisi istologiche di lesioni al fegato acuto alcolico in Zebrafish
Summary
Questo protocollo descrive le analisi istologiche dei fegati delle larve di zebrafish che sono state trattate con 2% di etanolo per 24 ore. Tale trattamento di etanolo acuto provoca steatosi epatica e gonfiore della vasculatura epatica.
Abstract
Malattia alcolica del fegato (ALD) si riferisce a danni al fegato a causa di abuso acuto o cronico di alcol. È tra le principali cause della morbilità e della mortalità correlate all'alcol e colpisce più di 2 milioni di persone negli Stati Uniti. Una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari alla base del danno epatico indotto da alcool è cruciale per lo sviluppo di un trattamento efficace per ALD. Le larve di Zebrafish mostrano steatosi epatica e fibrogenesis dopo solo 24 ore di esposizione al 2% di etanolo, rendendole utili per lo studio di lesioni al fegato alcoliche acute. Questo lavoro descrive la procedura per il trattamento acuto di etanolo nelle larve di zebrafish e mostra che provoca steatosi e gonfiori dei vasi sanguigni epatici. Viene descritto anche un protocollo dettagliato per la colorazione di ematossilina e di Eosin (H & E) ottimizzato per l'analisi istologica del fegato di larve zebrafish. La colorazione H & E ha diversi vantaggi unici rispetto all'immunofluorescenza, in quanto segna tutti i livelliEr cellule e componenti extracellulari contemporaneamente e può facilmente rilevare lesioni epatiche, come la steatosi e la fibrosi. Dato l'aumento dell'uso di zebrafish nella modellizzazione della tossina e della lesione epatica indotta dal virus, nonché delle patologie epatiche ereditarie, questo protocollo serve come riferimento per le analisi istologiche eseguite in tutti questi studi.
Introduction
La malattia alcolica del fegato (ALD), causata dal consumo di alcol, è una delle principali cause della morbilità e della mortalità correlate all'alcol. Negli Stati Uniti, quasi la metà delle morti per malattie epatiche coinvolge l'alcool 1 e l'ALD è responsabile di quasi 1 su 3 trapianti di fegato 2 . ALD ha un ampio spettro. La steatoside, caratterizzata da un eccesso di accumulo lipidico negli epatociti, si verifica nella fase iniziale del consumo pesante ed è reversibile alla cessazione dell'uso dell'alcol. Sotto l'influenza dei fattori genetici e ambientali e dell'assunzione continua dell'alcol, la steatosi epatica può progredire all'epatite alcolica e, alla fine, alla cirrosi 3 . Gli studi che utilizzano i modelli di roditore ALD hanno fornito conoscenze approfondite sulla malattia, ma hanno limitazioni (esaminate nel riferimento 3 ). L'alimentazione orale di una dieta dell'alcool provoca solo steatosi nei roditori 4 , </ Sup> 5 . Lo sviluppo di infiammazione e fibrosi richiede un secondo insulto 6 , 7 o infusione intragastrica cronica, che è invasiva e tecnicamente impegnativa 8 , 9 . Il teleost zebrafish sviluppa anche lesioni epatiche in risposta sia al trattamento alcolico cronico che acuto 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . In particolare, il pesce zebra di larve rappresenta un attraente organismo modello complementare in cui studiare lesioni al fegato alcoliche acute , 10 , 11 , 13 , 15 . Il fegato di zebrafish è funzionale e produce enzimi chiave per il metabolismo dell'etanolo da 4 giorni(Dpf) 13 , 16 , 17. L' etanolo può essere aggiunto direttamente all'acqua e l'esposizione al 2% di etanolo per 24 ore è sufficiente a indurre steatosi epatica e risposte fibrogeniche nelle larve 13 e 15 dello zebrafish.
È stato riportato che il trattamento con 2% di etanolo per 24 ore ha determinato una concentrazione di etanolo tessuto di 80 mM nelle larve 13 di zebrafish. Altri hanno dimostrato che le larve tollerano questa concentrazione ei fenotipi epatici osservati negli animali trattati sono specifici per l'esposizione di etanolo 11 , 13 , 15 , 18 . Tuttavia, poiché 80 mM è quasi letale negli esseri umani 19 , è importante valutare l'istologia epatica del pesce zebra trattato con etanolo e rilevareDistruggere la rilevanza fisiologica dell'uomo.
Il rapido sviluppo esterno e la traslucenza delle larve dello zebrafish permettono di caratterizzare l'azione dell'alcool nel fegato in tempo reale e in campioni fissi. La disponibilità di linee transgeniche fluorescenti specifiche di tipo cellulare e dei recenti progressi nella microscopia confocale facilitano lo studio di come diversi tipi di cellule epatiche cambino la loro morfologia e il loro comportamento in risposta al trattamento acuto di etanolo 11,15. Tuttavia, l'imaging confocale dei pesci zebra transgenici fluorescenti non può completamente sostituire la colorazione di ematossilina e di Eosin (H & E) durante lo studio dell'istologia del fegato. Marcando tutti i tipi di cellule epatiche contemporaneamente utilizzando zebrafish transgenici richiede la generazione di singole linee transgeniche, ciascuna etichettatura di un tipo di cellule epatiche con un unico fluoroforo. Introdurre diversi sfondi transgenici nello stesso pesce richiede la razzaG generazioni multiple, che richiede tempo e sono costosi. È necessaria una colorazione immunofluorescenza aggiuntiva per rilevare componenti di matrice extracellulare. La colorazione H & E, invece, identifica contemporaneamente tutti i tipi di cellule epatiche e le componenti della matrice extracellulare, fornendo così una panoramica del fegato 20 . Inoltre, rivela facilmente varie caratteristiche istopatologiche delle malattie epatiche, come la morte epatocitaria, la steatosi e la fibrosi. Anche se H & E è una macchia di routine nell'istologia del fegato mammifero, non è comunemente utilizzata nella ricerca epatica del zebrafish e il protocollo è meno ben definito.
Questo lavoro descrive un protocollo per il trattamento acuto di etanolo nelle larve di zebrafish e per le analisi istologiche di follow-up con la colorazione H & E. Il protocollo di colorazione H & E può essere utilizzato in tutti gli studi di sviluppo e funzionalità del fegato. Inoltre, le sezioni di paraffina possono essere utilizzate per immunohistochemistry, come pure per altri sta sta specialiIns nella patologia epatica, tra cui la macchia tricromica, la macchia di reticulina, ecc .
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo attuale descrive una procedura dettagliata per il trattamento acuto di etanolo nelle larve di zebrafish e le successive analisi istopatologiche con la colorazione H & E. Il trattamento acuto di etanolo dovrebbe essere effettuato non prima di 96 ore dopo la fecondazione, in quanto questo è il momento in cui il fegato di zebra inizia a esprimere enzimi che metabolizzano l'alcool 13 . 2% di etanolo è la dose massima che le larve possono tollerare 13 <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere il dottor Katy Murray al Centro Risorse Internazionali di Zebrafish; Il dottor Stacey Huppert e Kari Huppert al CCHMC, per i loro consigli utili sul protocollo; E il servizio veterinario CCHMC, per la cura dei pesci. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH R00AA020514 e da una borsa di studio del Centro per la Genomica Pediatrica a CCHMC (a CY). È stato anche sostenuto in parte da NIH concedere P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) del Centro di Ricerca Digestiva Disease Core a Cincinnati.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
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