Zebra balığıda Akut Alkollü Karaciğer Hasarının Histolojik Analizi
Summary
Bu protokol 24 saat boyunca% 2 etanol ile işlenmiş zebrafish larva karaciğerlerinin histolojik analizlerini tanımlamaktadır. Böyle akut etanol tedavisi hepatik steatoz ve hepatik vaskülatürün şişmesi ile sonuçlanır.
Abstract
Alkolik Karaciğer Hastalığı (ALD), akut veya kronik alkol bağımlılığı nedeniyle karaciğerde hasar anlamına gelmektedir. Alkolle ilişkili morbidite ve mortalitenin başlıca nedenleri arasındadır ve Birleşik Devletler'de 2 milyondan fazla kişiyi etkilemektedir. ALD'ye etkili tedavi geliştirmek için alkolle indüklenen karaciğer hasarının altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması önemlidir. Zebra balığı larvaları akut alkollü karaciğer hasarının çalışması için yararlı olan% 2 etanolün sadece 24 saat maruz kaldıktan sonra hepatik steatoz ve fibrojenez sergilerler. Bu çalışma, zebra balığı larvalarında akut etanol tedavisi için prosedürü açıklamakta ve hepatit kan damarlarında steatoz ve şişmeye neden olduğunu göstermektedir. Hematoksilin ve Eozin (H & E) boyama için zebra balığı iri karaciğerinin histolojik analizi için optimize edilmiş ayrıntılı bir protokol de açıklanmaktadır. H & E boyaması, immünofloresansa kıyasla birçok benzersiz avantaja sahiptir, çünkü tüm canlıları işaretlemektedirEr hücreleri ve hücre dışı bileşenleri aynı anda tespit edebilir ve steatoz ve fibroz gibi hepatik hasarı kolayca tespit edebilir. Toksik ve virüs kaynaklı karaciğer hasarının ve kalıtsal karaciğer hastalıklarının modellenmesinde zebra bibinin artan kullanımı göz önüne alındığında, bu protokol bu çalışmaların tamamında yapılan histolojik analizler için bir referans görevi görür.
Introduction
Alkol tüketimi nedeniyle oluşan Alkolik Karaciğer Hastalığı (ALD), alkol ile ilişkili morbidite ve mortalitenin ana nedenidir. Amerika Birleşik Devletleri'nde karaciğer hastalığının ölümlerinin yaklaşık yarısında alkol 1 ve ALD 3 karaciğer naklinde neredeyse 1'den sorumludur 2 . ALD geniş bir spektruma sahiptir. Hepatositlerde aşırı lipid birikimi ile karakterize olan steatoz, ağır içmenin erken evresinde ortaya çıkar ve alkol kullanımının durması üzerine geri döndürülebilir. Genetik ve çevresel faktörlerin etkisi altında ve devam eden alkol alımıyla hepatik steatoz alkolik hepatite ve nihayetinde siroza ilerleyebilir. Kemirgen ALD modellerini kullanan çalışmalar, hastalığa dair önemli bilgiler sağlamıştır, ancak sınırlamaları vardır (referans 3'de gözden geçirilmiştir). Bir alkol diyetinin oral yemi sadece kemirgenlerde steatoza neden olur 4 , </ Sup> 5 . İnflamasyon ve fibroz gelişiminde 6 , 7 ya da invaziv ve teknik açıdan zorlayıcı olan kronik intragastrik infüzyon ikinci bir hakaret gerektirir ( 8 , 9) . Teleost zebrafish ayrıca hem kronik hem de akut alkol tedavisine yanıt olarak karaciğer hasarını geliştirir 10,11,12,13,14,15. Özellikle larval zebra balığı, akut alkollü karaciğer hasarının 10 , 11 , 13 , 15 incelerken çekici bir tamamlayıcı model organizmayı temsil eder. Zebra balığı karaciğeri fonksiyoneldir ve etanol metabolizması için 4 gün boyunca anahtar enzimler üretir(Dpf) 13 , 16 , 17.Etanol doğrudan suya eklenebilir ve 24 saat süreyle% 2 etanol ile maruz bırakılması, zebrafish larvalarında hepatik steatoz ve fibrojenik yanıtları indüklemek için yeterlidir 13,15.
24 saat süreyle% 2 etanol ile işlemden geçirildiğinde zebra balığı larvaları 13'de 80 mM'lik bir etanol etanol konsantrasyonu ortaya çıktığı bildirilmiştir. Diğerleri larvaların bu konsantrasyonu tolere ettiğini ve tedavi edilen hayvanlarda görülen karaciğer fenotiplerinin etanol maruziyetine özgü olduğunu 11 , 13 , 15 , 18 göstermiştir. Bununla birlikte, 80 mM, insanlarda 19 ölümcül olduğu için, etanol ile işlemden geçirilmiş zebra balığı ve karaciğer histolojisini değerlendirmek önemlidirİnsanlara fizyolojik olarak uygunluğunu söyleyin.
Zebra balığı larvalarının hızlı harici gelişimi ve yarı saydamlığı, karaciğerdeki alkolün gerçek zamanlı ve sabit numunelerde oluştuğunu karakterize etmeyi mümkün kılar. Hücre tipine spesifik fluoresan transgenik çizgilerin varlığı ve konfokal mikroskopide son gelişmeler akut etanol tedavisine yanıt olarak farklı karaciğer hücre tiplerinin morfolojilerini ve davranışlarını nasıl değiştirdiklerini araştırmayı kolaylaştırır 11,15. Bununla birlikte, floresan transgenik zebra bifsiğinin konfokal görüntülemesi, karaciğer histolojisini incelerken Hematoksilen ve Eozinin (H & E) boyamasının tamamen yerini alamaz. Transgenik zebra balığı kullanarak tüm karaciğer hücre tiplerini aynı anda işaretlemek, her biri bir karaciğer hücresi türünü benzersiz bir florofor ile etiketleyen bireysel transgenik çizgilerin üretilmesini gerektirir. Aynı balıkta farklı transgenik arka planlar getirmek breedin'i gerektirirG çok kuşaktır, bu da zaman alıcı ve maliyetlidir. Ekstra immünofloresan boyama, hücre dışı matris bileşenlerini saptamak için gereklidir. Öte yandan, H & E boyası, tüm karaciğer hücre tiplerini ve hücre dışı matris bileşenlerini aynı anda etiketlendirir, böylece karaciğer 20'ye genel bir bakış sağlar. Dahası, karaciğer hastalıklarının, hepatosit ölümü, steatoz ve fibroz gibi çeşitli histopatolojik özelliklerini kolayca ortaya çıkarmaktadır. H & E, memeli karaciğer histolojisinde rutin bir leke olmasına rağmen, zebra balığı karaciğer araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaz ve protokol daha az kuruludur.
Bu çalışma, zebra balığı larvalarında akut etanol tedavisi için ve H & E boyaması ile izlem histolojik analizleri için bir protokolü açıklamaktadır. H & E boyama protokolü, karaciğer gelişimi ve işlevi ile ilgili tüm araştırmalarda kullanılabilir. Ayrıca, parafin bölümleri immünohistokimyasal olarak ve diğer özel staTrichrome boyası, retikülin lekesi vb . Dahil karaciğer patolojisinde ins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol, zebrafish larvalarında akut etanol muamelesi ve ardından H & E boyaması ile yapılan histopatolojik analizler için ayrıntılı bir prosedürü açıklamaktadır. Akut etanol tedavisi döllenmeden 96 saat önce yapılmalıdır, zebra balığı karaciğeri alkol metabolize eden enzimleri 13 ifade etmeye başlar. % 2 etanol, larvaların tolere edebileceği azami doz 13 , 14'tür . Etanol ile işlemden geçirilen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Zebra balığı Uluslararası Kaynak Merkezi'ndeki Dr. Katy Murray'ı kabul etmek istiyor; Protokol hakkında faydalı tavsiyeler için Dr. Çavuşoğlu Stacey Huppert ve Kari Huppert; Ve CCHMC veterinerlik hizmetleri, balık bakımı için. Bu çalışma, NIH hibe R00AA020514 tarafından desteklendi ve CCHMC'deki Pediatrik Genomik Merkezi'nden (CY'ye) bir araştırma ödeneği aldı. Ayrıca kısmen Cincinnati'deki Sindirim Hastalığı Araştırma Merkezi Merkezinin NIH hibe P30 DK078392 (Bütünleştirici Morfoloji Çekirdeği) tarafından desteklendi.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
- Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. . Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , 2000-2011 (2014).
- Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
- Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
- Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
- Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
- Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
- Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
- Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
- Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
- Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
- Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
- Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
- Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
- Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
- Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
- Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
- Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
- Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
- Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
- Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).
