Análisis histológicos de lesiones hepáticas alcohólicas agudas en peces cebra
Summary
Este protocolo describe el análisis histológico de los hígados de larvas de pez cebra que se han tratado con etanol al 2% durante 24 h. Este tratamiento agudo con etanol da lugar a esteatosis hepática ya hinchamiento de la vasculatura hepática.
Abstract
Alcoholic Liver Disease (ALD) se refiere al daño al hígado debido al abuso de alcohol agudo o crónico. Está entre las principales causas de morbilidad y mortalidad relacionadas con el alcohol y afecta a más de 2 millones de personas en los Estados Unidos. Una mejor comprensión de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la lesión hepática inducida por el alcohol es crucial para el desarrollo de un tratamiento eficaz para la ALD. Las larvas de pez cebra presentan esteatosis hepática y fibrogénesis después de sólo 24 horas de exposición a etanol al 2%, lo que las hace útiles para el estudio de la lesión hepática alcohólica aguda. Este trabajo describe el procedimiento para el tratamiento de etanol agudo en larvas de pez cebra y muestra que causa esteatosis e hinchazón de los vasos sanguíneos hepáticos. También se describe un protocolo detallado para la tinción con hematoxilina y eosina (H & E) que se optimiza para el análisis histológico del hígado larval del pez cebra. La tinción de H & E tiene varias ventajas únicas sobre la inmunofluorescencia, ya queEr y los componentes extracelulares simultáneamente y pueden detectar fácilmente lesión hepática, tal como esteatosis y fibrosis. Dado el uso creciente de pez cebra en el modelado de la toxina y la lesión hepática inducida por virus, así como las enfermedades hepáticas hereditarias, este protocolo sirve como referencia para los análisis histológicos realizados en todos estos estudios.
Introduction
La enfermedad hepática alcohólica (ALD), que es causada por el consumo excesivo de alcohol, es una causa importante de morbilidad y mortalidad relacionadas con el alcohol. En los Estados Unidos, casi la mitad de las muertes por enfermedad hepática implican alcohol 1 , y ALD es responsable de casi 1 de cada 3 trasplantes de hígado [ 2] . ALD tiene un amplio espectro. La esteatosis, que se caracteriza por un exceso de acumulación de lípidos en los hepatocitos, se produce en la etapa temprana del consumo intensivo de alcohol y es reversible al cesar el consumo de alcohol. Bajo la influencia de factores genéticos y ambientales y la ingesta continua de alcohol, la esteatosis hepática puede progresar a la hepatitis alcohólica y, finalmente, la cirrosis 3 . Los estudios que usan los modelos ALD de roedores han aportado ideas sustanciales sobre la enfermedad, pero tienen limitaciones (revisadas en la referencia 3 ). La alimentación oral de una dieta con alcohol sólo causa esteatosis en roedores 4 , </ Sup> 5 . El desarrollo de la inflamación y la fibrosis requiere un segundo insulto 6 , 7 o una infusión intragástrica crónica, que es invasiva y técnicamente desafiante 8 , 9 . El pez cebra teleósteo también desarrolla lesión hepática en respuesta al tratamiento de alcohol crónico y agudo 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . En particular, el pez cebra larvario representa un organismo modelo complementario atractivo en el que estudiar la lesión hepática alcohólica aguda 10 , 11 , 13 , 15 . El hígado de pez cebra es funcional y produce enzimas clave para el metabolismo del etanol por 4 días(Dpf) 13 , 16 , 17. El etanol se puede añadir directamente al agua y la exposición a etanol al 2% durante 24 h es suficiente para inducir esteatosis hepática y respuestas fibrogénicas en larvas de pez cebra 13,15.
Se ha informado de que el tratamiento con etanol al 2% durante 24 h dio lugar a una concentración de etanol de tejidos de 80 mM en larvas de pez cebra [ 13] . Otros han demostrado que las larvas toleran esta concentración y los fenotipos hepáticos observados en los animales tratados son específicos de la exposición al etanol 11 , 13 , 15 , 18 . Sin embargo, debido a que 80 mM es casi letal en los seres humanos 19 , es importante evaluar la histología del hígado de zebrafish tratado con etanol y deteDeterminar la relevancia fisiológica para los seres humanos.
El rápido desarrollo externo y la translucencia de las larvas de pez cebra permiten caracterizar la acción del alcohol en el hígado en tiempo real y en muestras fijas. La disponibilidad de líneas transgénicas fluorescentes específicas del tipo de célula y los recientes avances en microscopía confocal facilitan el estudio de cómo diferentes tipos de células hepáticas cambian su morfología y comportamiento en respuesta al tratamiento agudo con etanol 11 , 15 . Sin embargo, la imagen confocal del pez cebra transgénico fluorescente no puede sustituir por completo a la tinción con hematoxilina y eosina (H & E) cuando se estudia la histología del hígado. La marcación de todos los tipos de células hepáticas al mismo tiempo utilizando transgénicos pez cebra requiere la generación de líneas transgénicas individuales, cada una de las etiquetas de un tipo de células del hígado con un único fluoróforo. Introducción de diferentes fondos transgénicos en el mismo pez requiere breedinG generaciones múltiples, lo cual requiere mucho tiempo y es costoso. Se necesita tinción de inmunofluorescencia adicional para detectar componentes de la matriz extracelular. Por otro lado, la tinción con H & E marca simultáneamente todos los tipos de células hepáticas y componentes de la matriz extracelular, proporcionando así una visión general del hígado 20 . Además, revela fácilmente varios rasgos histopatológicos de enfermedades hepáticas, tales como muerte hepatocitaria, esteatosis y fibrosis. Aunque H & E es una mancha de rutina en la histología del hígado de mamíferos, no se utiliza comúnmente en la investigación del hígado de pez cebra, y el protocolo está menos bien establecido.
Este trabajo describe un protocolo para el tratamiento de etanol agudo en larvas de pez cebra y para el seguimiento de los análisis histológicos con tinción de H & E. El protocolo de tinción de H & E puede utilizarse en todos los estudios sobre el desarrollo y la función del hígado. Además, las secciones de parafina pueden utilizarse para inmunohistoquímica, así como para otrasIns en la patología hepática, incluyendo la tinción tricrómica, tinción reticulina, etc.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo actual describe un procedimiento detallado para el tratamiento de etanol agudo en larvas de pez cebra y los análisis histopatológicos posteriores con tinción de H & E. Tratamiento agudo de etanol debe llevarse a cabo no antes de las 96 h post-fertilización, ya que esta es la etapa en la que el hígado de pez cebra comienza a expresar las enzimas que metabolizan el alcohol [ 13] . 2% de etanol es la dosis máxima que las larvas pueden tolerar 13 ,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la Dra. Katy Murray en el Centro Internacional de Recursos de Zebrafish; Dr. Stacey Huppert y Kari Huppert en CCHMC, por sus útiles consejos sobre el protocolo; Y el servicio veterinario del CCHMC, para el cuidado de los peces. Este trabajo fue apoyado por NIH subvención R00AA020514 y una beca de investigación del Centro de Genómica Pediátrica en CCHMC (a CY). También fue apoyado en parte por la subvención NIH P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) del Centro de Investigación de Enfermedades Digestivas Centro en Cincinnati.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
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