מורין קצר ציר הלב ואת פרוסות הלב עבור מחקרים אלקטרו
Summary
כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות חדר קיימא מעכברים בוגרים ושימוש שלהם עבור הקלטות אלקטרודה פעולה פוטנציאליים חדים. אלה תכשירים תאיים לספק השתמר in vivo כמו מבנה רקמות, מה שהופך אותם מודל יקר עבור מחקרים אלקטרו-פרמקולוגיים במבחנה .
Abstract
Muriomyocytes Murine כבר בשימוש נרחב עבור במבחנה מחקרים של פיזיולוגיה של הלב ואסטרטגיות טיפוליות חדשות. עם זאת, הכנות רב תאיים של cardiomyocytes ניתק אינם נציג של מורכבות במבנה vivo של cardiomyocytes, שאינם myocytes ו מטריקס תאיים, אשר משפיע הן תכונות מכניות אלקטרו electiysiological של הלב. כאן אנו מתארים טכניקה להכין פרוסות חדרתי קיימא של לבבות העכבר הבוגרים עם השתמר in vivo כמו מבנה רקמות, ולהפגין את התאמתם הקלטות אלקטרו. לאחר כריתה של הלב, החדרים מופרדים מן אטריה, perfused עם Ca 2 + ללא פתרון המכיל 2,3-butanedione monoxime ו מוטבע ב 4% נמוך להמיס agarose לחסום. הבלוק ממוקם על microtome עם להב רוטט, פרוסות רקמות עם עובי של 150-400 מיקרומטר מוכנים לשמור על רטט חופשיתשל הלהב ב 60-70 הרץ והעברת הלהב קדימה לאט ככל האפשר. עובי הפרוסות תלוי ביישום נוסף. פרוסות מאוחסנים פתרון קרח קר של Tyrode עם 0.9 מ"מ Ca 2 + ו 2,3-butanedione monoxime (BDM) במשך 30 דקות. לאחר מכן, פרוסות מועברים 37 מעלות צלזיוס DMEM למשך 30 דקות לשטוף את BDM. פרוסות ניתן להשתמש עבור מחקרים אלקטרופיזי עם אלקטרודות חדות או מערכים אלקטרודה מיקרו, עבור מדידות כוח לנתח את הפונקציה התכווצות או לחקור את האינטראקציה של cardiomyocytes נגזר בתאי גזע המושתל ואת רקמת המארח. לקבלת הקלטות אלקטרודה חדה, פרוסה ממוקמת לתוך צלחת 3 ס"מ תרבות התא על צלחת חימום של מיקרוסקופ הפוך. פרוסת הוא מגורה עם אלקטרודה חד קוטבית, ואת הפוטנציאל פעולה תאיים של cardiomyocytes בתוך הפרוסה נרשמות עם אלקטרודת זכוכית חדה.
Introduction
פרוסות רקמות דקות נעשה שימוש תכוף במדע בסיסי מאז ימאמוט ומקלווין הראה בשנת 1966 כי הפעילות החשמלית של פרוסות המוח נשמרת במבחנה 1 . מאז, מחקרים אלקטרוכימיים ופרמקולוגיים נערכו על פרוסות מהמוח 2 , כבד 3 , ריאה 4 ורקמת שריר הלב 5 , 6 , 7 . הראשון תיקון מהדק הקלטות בפרוסות חדרית לבבות חולדה בילודים תוארו בשנת 1990 8 , אבל טכניקה זו נפל לתוך שכחה במשך זמן מה. יותר מעשור לאחר מכן, הקבוצה שלנו הקימה שיטה חדשה להכין Murine עובריים 9 , neonatal 10 ומבוגר 11 פרוסות לב. אלה פרוסות רקמות קיימא ניתן להשתמש עבור ניסויים חריפים (פרוסה למבוגריםS יכול להיות מעובד במשך כמה שעות) או ניסויים תרבות לטווח קצר (פרוסות עובריים ו neonatal יכול להיות מעובד במשך כמה ימים). פרוסות להראות in vivo כמו מאפיינים electrophysiological ו עירור הומוגני להתפשט כפי שהוערך על ידי פעולה אלקטרודה חדה פוטנציאל הקלטות מיקרו אלקטרודה מערך 11 . בשל המורפולוגיה "דו מימדי" שלהם, הם מאפשרים גישה ישירה של אלקטרודות הקלטה לכל האזורים של החדר, מה שהופך אותם כלי מעניין עבור חקירות אלקטרופיולוגיות מעלה אפשרויות ניסיוניות חדשות בהשוואה Langendorff-perfused לב שלם. תגובה של סמים של פרוסות לחסיני תעלות יונים כמו verapamil (L-Ca Ca 2 + -channel blocker), lidocain (Na + -חוסך חוסך), 4-aminopyridine (מתח לא תלוי ב- K + -channel blocker) ו- linopirdine (KCNQ K + -חוסך חשמל) 9 , 11 </suP> התואם השפעות ידועות על cardiomyocytes ניתק. מדידות כוח איזומטרי חשף קשר חיובי תדר כוח והציע בתוקף תפקוד שלם שלם. ממצאים אלה הראו כי פרוסות החדר Murine מתאימים כמודל רקמות במבחנה עבור מחקרים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים. יתר על כן, פרוסות חדר הלב של לב המקבל בשילוב עם הקלטות אלקטרודה חדה הוכיחו להיות כלי מועיל מאוד לאפיין אינטגרציה חשמלית ומכנית כמו גם התבגרות של העובר השתלה 12 , 13 , 14 ותאי גזע נגזר 15 cardiomyocytes.
לסיכום, פרוסות חדרית הם בעלי ערך רב להקים מודל רקמות רב תאיים ויש לראות משלימים cardiomyocytes ניתק Langendorff- perfused לבבותב מחקר קרדיווסקולרי, עם היתרון העיקרי של מתן in vivo כמו מבנה רקמות (בניגוד לתאי ניתק) כמו גם גישה ישירה של טכנולוגיות מדידה כמו הקלטות אלקטרודה חדה לכל אזורי הלב (בניגוד כל ההכנות הלב).
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוסות חדרית מאפשרים מחקרים אלקטרו-מכאניים, פרמקולוגיים ומכניים עם שימור במבנה רקמות ויוו וגישה ישירה של טכנולוגיית המדידה לכל אזורי הלב. תכונות פוטנציאליות פעילות פיזיולוגית הוכחו בפרוסות עובריים, ילודים ומבוגרים 9 , 10 , <s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בתמיכת הסדנאות ובמתקן החיות של המכון לנוירופיזיולוגיה. עבודה זו נתמכה על ידי וולטר או מרגה בול Stiftung, Köln Fortune ו דויטשה Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 ml Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27Gx3/4“ Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20G 11/2“ Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
Riferimenti
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts–a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
