Racimos del corazón ventricular de eje corto murino para estudios electrofisiológicos

Summary

Aquí, describimos la preparación de cortes ventriculares viables de ratones adultos y su uso para registros de potencial de acción de electrodos agudos. Estas preparaciones multicelulares proporcionan una estructura de tejido conservada in vivo como, lo que los convierte en un valioso modelo para estudios electrofisiológicos y farmacológicos in vitro .

Abstract

Los cardiomiocitos murinos se han utilizado ampliamente para estudios in vitro de fisiología cardiaca y nuevas estrategias terapéuticas. Sin embargo, las preparaciones multicelulares de cardiomiocitos disociados no son representativas de la compleja estructura in vivo de cardiomiocitos, no miocitos y matriz extracelular, que influye tanto en las propiedades mecánicas como electrofisiológicas del corazón. Aquí se describe una técnica para preparar viable ventricular rodajas de corazones de ratón de adultos con un preservado in vivo como estructura de tejido, y demostrar su idoneidad para electrofisiológicos grabaciones. Después de la excisión del corazón, los ventrículos se separan de las aurículas, se perfunden con solución libre de Ca2 ⁺ que contiene 2,3-butanodiona monóxima y se insertan en un bloque de agarosa de bajo punto de fusión al 4%. El bloque se coloca sobre un micrótomo con una hoja vibrante, y se preparan rebanadas de tejido con un espesor de 150-400 μm, manteniendo la vibración freDe la cuchilla a 60-70 Hz y moviendo la hoja hacia adelante lo más lentamente posible. El espesor de las rebanadas depende de la aplicación posterior. Las rodajas se almacenan en solución de Tyrode helada con Ca2 ⁺ 0,9 mM y 2,3-butanodiona monóxima (BDM) durante 30 min. Después, las rebanadas se transfieren a DMEM a 37ºC durante 30 minutos para lavar el BDM. Los cortes se pueden utilizar para estudios electrofisiológicos con electrodos afilados o matrices de microelectrodos, para mediciones de fuerzas para analizar la función contráctil o para investigar la interacción de cardiomiocitos derivados de células madre trasplantados y tejido huésped. Para grabaciones de electrodo agudo, se coloca una rebanada en un plato de cultivo celular de 3 cm sobre la placa calefactora de un microscopio invertido. La rebanada se estimula con un electrodo unipolar, y los potenciales de acción intracelular de los cardiomiocitos dentro de la rebanada se registran con un electrodo de vidrio afilado.

Introduction

Las rebanadas de tejido fino se han utilizado con frecuencia en la ciencia básica ya que Yamamot y Mcllwain demostraron en 1966 que la actividad eléctrica de las rebanadas del cerebro se mantiene in vitro ¹ . Desde entonces, se han realizado estudios electrofisiológicos y farmacológicos sobre cortes de cerebro ² , hígado ³ , pulmón ⁴ y tejido miocárdico ^{5 , 6 , 7} . En 1990 se describieron las primeras grabaciones de parche-clamp en rodajas ventriculares de corazones de ratas neonatales, pero esta técnica cayó en el olvido durante algún tiempo. Más de una década más tarde, nuestro grupo estableció un nuevo método para preparar murino embrionario ⁹ , neonatal ¹⁰ y adultos ¹¹ rebanadas de corazón. Estos cortes de tejido viable se pueden utilizar para experimentos agudos (trozo de adultoS se pueden cultivar durante varias horas) o experimentos de cultivo a corto plazo (se pueden cultivar por unos días los cortes embrionarios y neonatales). Los cortes muestran in vivo como características electrofisiológicas y una propagación de excitación homogénea según se evaluó mediante un potencial de acción de electrodo nítido y grabaciones de electrodos de microelectrodos ¹¹ . Debido a su morfología "bidimensional", permiten el acceso directo de electrodos de grabación a todas las regiones del ventrículo, lo que las convierte en una herramienta interesante para las investigaciones electrofisiológicas y plantea nuevas opciones experimentales en comparación con los corazones enteros perfundidos de Langendorff. La respuesta de fármacos de los cortes a los bloqueadores de los canales iónicos como el verapamilo (bloqueador del canal de Ca ²⁺ tipo L), lidocaína (bloqueador del canal de Na ⁺ ), 4-aminopiridina (bloqueador de canal de K ⁺ dependiente del voltaje no selectivo) y linopirdina (KCNQ K ^{+ –} bloqueador de canales) ^{9 , 11} </suP> correspondieron a efectos conocidos sobre cardiomiocitos disociados. Medidas de fuerza isométrica reveló una relación de frecuencia de fuerza positiva y sugiere fuertemente la función contráctil intacta [ ^10] . Estos hallazgos demostraron que los cortes ventriculares murinos son adecuados como un modelo de tejido in vitro para estudios fisiológicos y farmacológicos. Además, las rodajas ventriculares de los corazones receptores en combinación con registros de electrodos agudos han demostrado ser una herramienta muy útil para caracterizar la integración eléctrica y mecánica, así como la maduración de ¹² cardiomiocitos fetales ^{12 , 13 , 14} y derivado de células madre trasplantados.

En resumen, las rodajas ventriculares son un modelo valioso y bien establecido de tejido multicelular y deben considerarse complementarias a los cardiomiocitos disociados y los corazones perfundidos de Langendorff(En contraste con las células disociadas), así como el acceso directo de las tecnologías de medición como registros de electrodos agudos a todas las regiones del corazón (en contraste con las preparaciones enteras del corazón).

Protocol

La manipulación de los animales debe ajustarse a las directrices del Comité local del bienestar de los animales ya la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo. 1. Preparar soluciones Preparar la solución de Tyrode sin Ca 2+ (composición en mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, glucosa 10, HEPES 5, 2,3-butanodiona monóxima (BDM) 30. Ajustar el pH a 7,4 Con NaOH a 4ºC. Preparar la solución de Tyrode con C…

Representative Results

El infarto de miocardio conduce a una pérdida virtualmente irreversible de cardiomiocitos. La terapia de reemplazo celular utilizando cardiomiocitos derivados de células madre para la regeneración cardíaca exógena es un enfoque terapéutico prometedor. La integración eléctrica y la maduración de las células trasplantadas son cruciales para la seguridad y la eficacia de la terapia de reemplazo celular. Para evaluar la …

Discussion

Las rodajas ventriculares permiten estudios electrofisiológicos, farmacológicos y mecánicos con una estructura de tejido conservada in vivo como y el acceso directo de la tecnología de medición a todas las regiones del corazón. Las propiedades potenciales de la acción fisiológica se han demostrado en rodajas embrionarias, neonatales y adultas ^{9 , 10 , 11} . La vitalidad de las rodajas, con la excepción…

Materials

Leica VT 1000s	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		Microtome with vibrating blade.
Stainless Steel Blades	Campden Instruments, Loughborough, England	7550-1-SS
Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	Z627992
Fine brush, e.g. size 6 (4/32")	VWR, International, Radnor, USA	149-2125
Preparation table			self made
Molt for embedding ventricles in agarose			self made
1 ml Syringe	Becton, Dickinson;  Franklin Lakes, USA	300013
27Gx3/4“ Needles	Braun, Melsungen, Germany	4657705
20G 11/2“ Needles		4657519
Small scissor	WPI, Sarasota, USA	501263
Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip	WPI, Sarasota, USA	500342
Oxygen gas (medical grade O2)	Linde, Munich, Germany
Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2)	Linde, Munich, Germany
NaCL	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	7647-14-5
KCL	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746436
CaCl2	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746495
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	NIST200B
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	51558
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S5761
D(+)-Glucose	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	G8270
MgSO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	M7506
NaOH	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S8045
Cyanoacrylate glue	Henkel, Düsseldorf, Germany
Low-melt Agarose	Roth, Karlsruhe, Germany	6351.2
Heparin-sodium-25000 I.E./5mL	Ratiopharm, Ulm, Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM), high glucose, GlutaMAX	ThermoScientific, Waltham, USA	10566016
SEC-10LX Amplifier	npi electronic GmbH, Tamm, Germany	SEC-10LX
EPC 9	HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany
Zeiss Axiovert 200	Zeiss, Oberkochen, Germany
Low magnification Micromanipulator	Narashige, Tokyo, Japan	Nm-3
High magnification, three-axis micromanipulator	Narashige, Tokyo, Japan	MHW-3
Peristaltic perfusion pump	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	PPS2
2-channel temperature controller	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	TCO02
Square pulse stimulator	Natus Europe GmbH, Planegg, Germany	Grass SD9
Glass capillaries	WPI, Sarasota, USA	1B150F-1