Aqui, descrevemos a preparação de fatias ventriculares viáveis de camundongos adultos e seu uso para gravações de potencial de ação de eletrodos afiados. Essas preparações multicelulares proporcionam uma estrutura de tecido in vivo preservada, o que os torna um modelo valioso para estudos eletrofisiológicos e farmacológicos in vitro .
Os cardiomiócitos murinos têm sido amplamente utilizados para estudos in vitro de fisiologia cardíaca e novas estratégias terapêuticas. No entanto, as preparações multicelulares de cardiomiócitos dissociados não são representativas da estrutura complexa in vivo de cardiomiócitos, não miocitos e matriz extracelular, que influencia as propriedades mecânicas e eletrofisiológicas do coração. Aqui descrevemos uma técnica para preparar fatias ventriculares viáveis de corações de mouse adultos com uma estrutura de tecido preservada in vivo e demonstrar sua adequação para gravações eletrofisiológicas. Após a excisão do coração, os ventrículos são separados dos átrios, perfundidos com solução livre de Ca2 + contendo monoxime de 2,3-butanodiona e incorporados em um bloqueio de agarose com baixo teor de fusão a 4%. O bloco é colocado em um microtomo com uma lâmina vibratória, e fatias de tecido com uma espessura de 150-400 μm são preparadas mantendo a vibração freDa lâmina a 60-70 Hz e movendo a lâmina para a frente o mais lentamente possível. A espessura das fatias depende da aplicação adicional. As fatias são armazenadas na solução de Tyrode gelada com Ca2 + 0,9 mM e monoxime de 2,3-butanodiona (BDM) durante 30 min. Depois, as fatias são transferidas para DMEM a 37 ° C durante 30 min para lavar o BDM. As fatias podem ser usadas para estudos eletrofisiológicos com eletrodos afiados ou arrays de microeletrodos, para medidas de força para analisar a função contrátil ou para investigar a interação de cardiomiócitos derivados de células estaminais transplantadas e tecido hospedeiro. Para gravações de eletrodos afiados, uma fatia é colocada em um prato de cultura de células de 3 cm na placa de aquecimento de um microscópio invertido. A fatia é estimulada com um eletrodo unipolar, e os potenciais de ação intracelular de cardiomiócitos dentro da fatia são registrados com um eletrodo de vidro afiado.
As fatias de tecido fino têm sido utilizadas com freqüência na ciência básica, uma vez que Yamamot e Mcllwain mostraram em 1966 que a atividade elétrica de fatias de cérebro é mantida in vitro 1 . Desde então, estudos eletrofisiológicos e farmacológicos foram realizados em fatias do cérebro 2 , fígado 3 , pulmão 4 e tecido miocárdico 5 , 6 , 7 . As primeiras gravações de patch-clamp em fatias ventriculares de corações de ratos neonatais foram descritas em 1990 8 , mas essa técnica caiu no esquecimento por algum tempo. Mais de uma década depois, nosso grupo estabeleceu um novo método para preparar as fatias de coração de embrião murino 9 , neonatal 10 e adulto 11 . Estas fatias de tecido viáveis podem ser usadas para experiências agudas (fatias adultasS podem ser cultivadas por várias horas) ou experiências culturais de curto prazo (fatias embrionárias e neonatais podem ser cultivadas por alguns dias). As fatias mostram in vivo como características eletrofisiológicas e uma dispersão de excitação homogênea conforme avaliado pelo potencial de ação de eletrodo afiado e gravações de microeletrodos 11 . Devido à sua morfologia "bidimensional", eles permitem o acesso direto dos eletrodos de gravação a todas as regiões do ventrículo, o que os torna uma ferramenta interessante para investigações eletrofisiológicas e levanta novas opções experimentais em comparação com os corações inteiros de perfumes de Langendorff. A resposta ao fármaco das fatias aos bloqueadores dos canais iônicos, como o verapamil (bloqueador de canal Ca 2+ ), lidocain (bloqueador de canais de Na + ), 4-aminopiridina (bloqueador de canal K + não -seletivo dependente da tensão) e linopirdina (KCNQ K + -Bloqueador de canal) 9 , 11 </suP> correspondeu a efeitos conhecidos em cardiomiócitos dissociados. As medidas da força isométrica revelaram uma relação de freqüência de força positiva e sugeriram fortemente a função contrátil intacta 10 . Esses achados demonstraram que as fatias ventriculares murinas são adequadas como um modelo de tecido in vitro para estudos fisiológicos e farmacológicos. Além disso, as fatias ventriculares de corações receptores em combinação com gravações afiadas de eletrodos provaram ser uma ferramenta muito útil para caracterizar a integração elétrica e mecânica, bem como a maturação dos 12 cardiomiócitos transplantados 12 , 13 , 14 e derivados de células-tronco.
Em resumo, as fatias ventriculares são um modelo de tecido multicelular valioso e bem estabelecido e devem ser consideradas complementares a cardiomiócitos dissociados e corações perfundidos por LangendorffNa pesquisa cardiovascular, com a principal vantagem de fornecer uma estrutura de tecido in vivo (em contraste com células dissociadas), bem como acesso direto de tecnologias de medição, como gravações de eletrodos afiados para todas as regiões do coração (em contraste com preparações de coração inteiro).
As fatias ventriculares permitem estudos eletrofisiológicos, farmacológicos e mecânicos com uma estrutura de tecido preservada in vivo e acesso direto da tecnologia de medição a todas as regiões do coração. As propriedades potenciais de ação fisiológica foram demonstradas em fatias embrionárias, neonatais e adultas 9 , 10 , 11 . A vitalidade das fatias, com exceção das camadas superficiais direta…
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos o apoio prestado pelas oficinas e a instalação animal do Instituto de Neurofisiologia. Este trabalho foi apoiado por Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune e Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
Preparation table | self made | ||
Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
1 ml Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
27Gx3/4“ Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
20G 11/2“ Needles | 4657519 | ||
Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
NaCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
KCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
Heparin-sodium-25000 I.E./5mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |