電気生理学的研究のためのマウス短軸心室スライス
Summary
ここでは、成体マウスからの生存心室スライスの調製および鋭い電極活動電位記録のためのそれらの使用を記載する。これらの多細胞調製物は、 インビボでの電気生理学的および薬理学的研究のための貴重なモデルとなる組織構造のような保存されたインビボを提供する。
Abstract
マウス心筋細胞は、心臓生理学および新しい治療戦略のインビトロ研究に広く使用されている。しかし、解離した心筋細胞の多細胞調製物は、心臓の機械的および電気生理学的特性の両方に影響を与える、心筋細胞、非心筋細胞および細胞外マトリックスの生体内構造の複合体を代表するものではない。ここでは、保存されたインビボのような組織構造を有する成体マウス心臓の実行可能な心室スライスを調製する技術を説明し、電気生理学的記録のためのそれらの適合性を実証する。心臓の切除後、脳室を心房から分離し、2,3-ブタンジオンモノオキシムを含有するCa 2+不含溶液で灌流し、4％ 低融点アガロースブロックに包埋する。このブロックを振動刃付きミクロトーム上に置き、厚さ150〜400μmの組織切片を作製し、振動をfreブレードを60-70Hzで回転させ、ブレードを可能な限りゆっくりと前進させる。スライスの厚さは、さらなる用途に依存する。スライスを、0.9mMのCa 2+および2,3-ブタンジオンモノオキシム（BDM）を含む氷冷Tyrode溶液に30分間保存する。その後、スライスを37℃のDMEMに30分間移してBDMを洗い流す。スライスは、収縮機能を分析するための力測定、または移植された幹細胞由来の心筋細胞と宿主組織との相互作用を調べるために、鋭利な電極または微小電極アレイを用いた電気生理学的研究に使用することができる。鋭い電極記録のために、スライスを倒立顕微鏡の加熱プレート上の3cm細胞培養皿に入れる。スライスを単極電極で刺激し、スライス内の心筋細胞の細胞内作用電位を鋭利なガラス電極で記録する。
Introduction
YamamotとMcllwainは1966年に脳切片の電気的活動がin vitroで維持されていることを示して以来、薄い組織切片が基礎科学で頻繁に使用されています1 。それ以来、脳2 、肝臓3 、肺4および心筋組織5,6,7の切片について電気生理学および薬理学的研究が行われてきた。新生児ラット心臓からの心室スライスにおける最初のパッチクランプ記録は1990年8月に記載されていたが、この技術はしばらくの間忘れ去られた。 10年以上後、我々のグループは、マウス胚9 、新生児10および大人11の心臓スライスを調製するための新しい方法を確立した。これらの生存可能な組織切片は、急性実験（成人スライス数時間栽培することもできる）または短期間の培養実験（胚および新生児スライスを数日間培養することができる）。スライスは、電気生理学的特徴および鋭い電極活動電位およびマイクロ電極アレイ記録11によって評価される均一な励起広がりのようなインビボで示す 。 「2次元」形態のため、脳室内のすべての領域に記録電極を直接アクセスすることができ、電気生理学的調査のための興味深いツールとなり、Langendorff灌流心臓全体と比較して新しい実験的選択肢をもたらす。ベラパミル（L型Ca 2+チャンネルブロッカー）、リドカイン（Na +チャンネルブロッカー）、4-アミノピリジン（非選択的電圧依存性K +チャンネルブロッカー）およびリノパルジン（KCNQ K）のようなイオンチャネルブロッカーに対するスライスの薬物応答は、 +チャンネルブロッカー） 9,11 </sup>は、解離した心筋細胞に対する既知の効果に対応した。等尺性力測定は正の力周波数関係を示し、無傷の収縮機能を強く示唆した10 。これらの発見は、マウス心室スライスが、生理学的および薬理学的研究のためのインビトロ組織モデルとして適切であることを実証した。さらに、鋭い電極記録と組み合わせたレシピエント心臓の心室スライスは、移植された胎児12,13,14および幹細胞由来の15の心筋細胞の電気的および機械的な統合ならびに成熟を特徴付ける非常に有用なツールであることが判明している。
要約すると、心室スライスは、価値ある、十分に確立した多細胞組織モデルであり、解離した心筋細胞およびランゲンドルフ灌流心臓に対して相補的であると考えられるべきである（解離した細胞とは対照的に） インビボのような組織構造を提供すること、および（心臓全体の準備とは対照的に）鋭い電極記録のような測定技術の直接的なアクセスを心臓の全ての領域に提供することの大きな利点がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
心室スライスは、組織構造のような保存されたインビボでの電気生理学的、薬理学的および機械的研究ならびに心臓のすべての領域への測定技術の直接アクセスを可能にする。生理学的作用潜在的特性は、胚、新生児および成人のスライス9,10,11において示されている。スライシング手順によって直接損傷された表面層を除いて、スライスの活性は、活力染色によって確認された<sup clas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、神経生理学研究所のワークショップと動物施設が提供する支援を認めています。この作品は、Walter und Marga Boll-Stiftung、KölnFortune、Deutsche StiftungfürHerzforschungによって支持されました。
Materials
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 ml Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27Gx3/4“ Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20G 11/2“ Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
Riferimenti
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