Summary
여기에는 생체 내 동일한 샘플 에서 심도 깊은 곳에서의 고해상도 이미징과 저해상도 깊은 조직 이미징이 가능한 스위칭 가능한 음향 해상도 (AR) 및 광학 해상도 (OR) 광 음향 현미경 (AR-OR-PAM) 시스템이 시연됩니다.
Abstract
Photoacoustic microscopy (PAM)는 광학 및 초음파를 모두 결합한 빠르게 성장하는 인비 보 이미징 양식으로 고해상도 의 광학 평균 자유 경로 (~ 1 mm 피부)를 넘어서는 침투를 제공합니다. 광학 흡수 콘트라스트와 초음파의 높은 공간 해상도를 단일 양식으로 결합함으로써이 기술은 심부 조직을 투과 할 수 있습니다. 광 음향 현미경 검사 시스템은 음향 해상도가 낮고 탐침 깊이가 크거나 광학 해상도가 높고 탐침을 얕게 가질 수 있습니다. 단일 시스템으로 높은 공간 해상도와 큰 깊이의 침투를 달성하는 것은 어려운 일입니다. 이 작품은 얕은 깊이에서 고해상도 이미징과 생체 내 동일한 샘플의 저해상도 심 조직 이미징이 가능한 AR-OR-PAM 시스템을 제시합니다. 음향 집속을 사용하여 광학 집속을 사용하는 1.4 mm 이미징 깊이와 7.8 mm 이미징 깊이로 45 μm의 측면 해상도를 사용한 4 μm의 측면 해상도결합 된 시스템을 사용하여 시연되었습니다. 여기서 생체 내 소 동물 혈관 조영술은 생물학적 이미징 능력을 입증하기 위해 수행됩니다.
Introduction
광학 결맞음 단층 촬영, 공 촛점 현미경 검사 및 다 광자 현미경 검사와 같은 고해상도 광학 이미징 양식은 많은 이점을 가지고 있습니다. 그러나 공간 해상도는 이미징 깊이가 증가함에 따라 크게 감소합니다. 이것은 연조직 1 , 2 에서의 빛 전달의 확산 성 때문입니다. 광학 여기와 초음파 검출의 통합은 깊은 조직에서의 고해상도 광학 이미징의 과제를 극복 할 수있는 솔루션을 제공합니다. Photoacoustic microscopy (PAM)는 다른 광학 이미징 양식보다 더 깊은 이미징을 제공 할 수있는 하나의 모달입니다. 그것은 성공적으로 생체 내 구조, 기능, 분자 및 세포 이미징에 적용되었습니다 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 9 , 10 , 11 , 12 , 13 연구를 수행했습니다.
PAM에서 짧은 레이저 펄스가 조직 / 샘플을 조사합니다. 발색단 ( 예 : 멜라닌, 헤모글로빈, 물 등 )에 의한 빛의 흡수는 온도 상승을 일으키며 결과적으로 음향 파 (photoacoustic waves)의 형태로 압력 파를 생성합니다. 생성 된 광 음파는 조직 경계 외부의 광대역 초음파 변환기로 감지 할 수 있습니다. 약한 광학 및 타이트한 음향 집속을 이용하여 음향 해상도 광 음향 현미경 (AR-PAM) 14 , 15 , 16 에서 심 조직 영상을 얻을 수 있습니다. AR에서-PAM, 45 μm의 수평 해상도 및 3 mm까지의 이미징 깊이가 시연되었습니다. 단일 모세관 (~ 5 μm)을 음향 적으로 해결하려면 400 MHz 이상의 중심 주파수에서 작동하는 초음파 변환기가 필요합니다. 이러한 높은 주파수에서, 침투 깊이는 100μm 미만이다. 단단한 음향 집속으로 인한 문제는 엄격한 광학 집속을 사용하여 해결할 수 있습니다. 광학 해상도 광 음향 현미경 (OR-PAM)은 단일 모세관 또는 단일 셀 17 을 분해 할 수 있으며 0.5 μm의 횡 분해능은 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24에 이릅니다 . 광자 나노 젯 (photonic nanojet)을 사용하면 회절 한계 해상도 이상의 해상도를 얻을 수 있습니다.n 25 , 26 . OR-PAM에서, 침투 깊이는 집속 (light focusing)으로 인해 제한되며, 생물학적 조직 ( 23) 내부에서 ~ 1.2mm까지 이미지 할 수 있습니다. 따라서 AR-PAM은 해상도는 더 높지만 해상도는 더 낮을 수 있으며 OR-PAM은 매우 높은 해상도로 이미지를 만들 수 있지만 이미지 깊이는 제한적입니다. AR 및 OR-PAM 시스템의 이미징 속도는 주로 레이저 소스 ( 27) 의 펄스 반복 속도에 의존한다.
AR-PAM과 OR-PAM을 결합하면 고해상도와 깊은 이미징을 모두 요구하는 어플리케이션에 큰 도움이됩니다. 이 시스템들을 결합하기위한 노력은 거의 없었다. 일반적으로 이미징에는 2 개의 서로 다른 이미징 스캐너가 사용되므로 샘플을 두 시스템간에 이동해야하므로 생체 내 이미징을 수행하기가 어렵습니다. 그러나 AR 및 OR PAM 모두를 사용한 하이브리드 이미징을 사용하면 확장 가능한 해상도로 이미지를 생성 할 수 있습니다.깊이. 하나의 접근법에서, AR 및 OR PAM 모두에 광을 전달하기 위해 광섬유 번들이 사용된다. 이 접근법에서는 2 개의 개별 레이저 (AR의 경우 570 nm의 고 에너지 레이저와 OR의 경우 532 nm의 저에너지, 높은 반복 속도의 레이저)가 사용되어 시스템이 불편하고 고비용이되었습니다. OR-PAM 레이저 파장은 고정되어 있으며 산소 포화도와 같은 많은 연구는이 결합 시스템을 사용하여 가능하지 않습니다. AR과 OR PAM 사이의 비교 연구는 AR과 OR 사이의 레이저 파장 차이 때문에 가능하지 않습니다. 또한 AR-PAM은 명 시야 조명을 사용합니다. 따라서 피부 표면의 강력한 광 음향 신호가 이미지 품질을 제한합니다. 이러한 이유로이 시스템은 많은 바이오 이미징 응용 프로그램에 사용할 수 없습니다. AR 및 OR PAM을 수행하는 또 다른 접근법에서는 광학 및 초음파 초점이 이동되어 광 초점 및 초음파 초점이 정렬되지 않습니다. 따라서 이미지 품질이 최적이 아닙니다. 30 . 이 모든 경우에 AR-PAM은 암시 야 조명을 사용하지 않았습니다. 암시 야 조명을 사용하면 피부 표면에서 강한 광 음향 신호가 생성되는 것을 줄일 수 있습니다. 따라서 깊은 광 음향 신호의 검출 감도가 명 시야 조명의 감도보다 높기 때문에 링 모양의 조명을 사용하여 심 조직 촬영을 수행 할 수 있습니다.
이 연구는 동일한 레이저 및 스캐너를 사용하여 동일한 샘플을 고해상도 이미징 및 저해상도 심 조직 이미징이 가능한 전환 가능한 AR 및 OR PAM (AR-OR-PAM) 이미징 시스템을보고합니다.ems. AR-OR-PAM 시스템의 성능은 가상 실험을 사용하여 공간 해상도와 영상 깊이를 결정함으로써 특성화되었습니다. 생체 내 혈액 vasculature 이미징은 생물 학적 이미징 능력을 입증하기 위해 마우스 귀에 수행되었습니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 싱가포르 남양 기술 대학교 (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 된 규정과 지침에 따라 수행되었습니다.
1. AR-OR-PAM 시스템 ( 그림 1 )
- 시스템 구성 : AR-PAM
- 다이오드 조사 방식의 고체 상태 Nd-YAG 레이저 (532 nm)와 559-576 nm의 조도 범위를 갖는 염료 레이저로 구성된 나노초 가변 파장 레이저 시스템을 광 조사 광원으로 사용하십시오. 외부 제어기를 사용하여 레이저 파장을 570 nm로 설정하고 레이저 소프트웨어를 사용하여 레이저의 반복 속도를 1 kHz로 설정하십시오.
- 가변 레이저 필터 (NDF1, OD = 0-4.0)를 통해 레이저 출력의 5 %를 광 다이오드로 전환하려면 레이저 앞에 45 ° 각도로 빔 샘플러를 배치합니다.
- 90 °에서 빔 샘플러를 사용하여 레이저 빔을 방향 전환합니다.직각 프리즘 (RAP1)을 포함한다.
- 다른 중립 밀도 프리즘 (RAP2)을 사용하여 광 중성 밀도 필터 (NDF2, OD = 0-4.0)와 멀티 모드 광섬유 (MMF)를 통과시켜 파이버 커플러 (FC) -a 목표 조합 (개구 수 (NA) : 0.25) 및 XY 변환기.
- XY 변환기를 사용하여 광섬유를 스캔 스테이지에 고정하십시오. 광섬유 출력 끝에서 25mm 떨어진 평행 볼록 렌즈 (L1)를 배치하여 광섬유에서 빔을 조준합니다.
- 130 °의 정점 각도를 가진 원추형 렌즈를 통해 평행 광선을 통과시켜 고리 모양의 광선을 생성합니다. cone 각이 70 ° 및 110 ° 인 수제 광학 콘덴서 (OC)를 사용하고 중앙에 구멍이있는 링 모양의 빔을 피사체에 약하게 초점을 맞 춥니 다.
- 집에서 만든 콘덴서의 중앙에 음향 렌즈 (AL)가있는 50 MHz 초음파 변환기 (UST)를 놓습니다.
- 시스템 구성 : OR-PAM
- 사용다이오드 펌핑 된 고체 상태의 Nd-YAG 레이저 (532 nm)와 559 - 576 nm의 조도 범위를 갖는 염료 레이저로 구성된 나노초 가변 파장 레이저 시스템. 외부 제어기를 사용하여 레이저 파장을 570 nm로 설정하고 레이저 소프트웨어를 사용하여 5 kHz에서 레이저의 반복 속도를 설정하십시오.
- 컴퓨터 제어 회전 스테이지 (RAP1 유지)를 90 ° 회전하여 레이저 빔을 조리개로 돌려 방향을 바꿉니다.
- 빔을 따라 가변 중성 필터 (OD : 0-4.0)를 배치 한 레이저 빔을 감쇄시킨 다음 콘덴서 렌즈 (CL)로 빔을 집중시킵니다. 공간 필터링을 위해 CL에서 75 mm 떨어진 핀홀 (PH)을 통과시킵니다.
- SMF에 광선을 집중시키기 위해 0.1 NA 대물 렌즈로 구성된 단일 모드 광섬유 커플러 (FC)를 사용하여 SMF (단일 모드 광섬유)로 공간 필터링 된 빔을 시작하십시오.
- 최대 커플 링 효율을 얻기 위해 파이버 커플러를 조정하십시오.
- 섬유를 t 위에 고정 시키십시오.그는 슬립 플레이트 (SP)를 사용하여 스테이지를 스캐닝한다. 레이저 빔을 평행하게 만들기 위해 SM 섬유에서 50mm 떨어진 색소 렌즈 (L2)를 놓습니다.
- 또 다른 동일한 무색 렌즈 (L3)의 후면 구경을 채우기 위해 운동 가능한 제어 타원형 거울 (M)을 사용하여 평행 광선을 90 ° 방향 전환하십시오. 렌즈 튜브 (LT)를 사용하여 초점을 맞추는 데 사용되는 무색 렌즈를 번역 마운트 (TM2)에 놓습니다.
- 사이에 실리콘 오일 (SO) 층이있는 직각 프리즘 (RA)과 편평한 프리즘 (RP)으로 구성된 수제 광 음향 빔 결합기를 통해 집속 빔을 전달하십시오.
참고 : 실리콘 오일 층은 광학적으로 투명하고 음향 적으로 반사되는 막 역할을합니다. - 마름모꼴 렌즈 (AL)를 부착하여 마름모꼴 프리즘의 바닥에 음향 집속 (초점 직경 : ~ 46 μm)을 제공하십시오.
- 마름모꼴 프리즘 상단에 50 MHz 중심 주파수의 초음파 트랜스 듀서를 놓습니다. 효과적인 커플 링을 위해 에폭시 층을 사용하십시오.
2. 시스템 스위칭 및 정렬 - 수제 전환 가능한 플레이트를 컴퓨터에 연결된 3 축 컨트롤러로 제어되는 3 축 전동 스테이지에 고정 (단단히 조여서).
- 케이지 마운팅 브래킷을 사용하여 AR 및 OR 케이지 시스템을 홈 메이드 플레이트에 부착하면 AR 및 OR 스캔 헤드를 쉽게 전환 할 수 있습니다. 스캔 헤드를 이미징 영역의 위쪽으로 밉니다.
- AR-OR-PAM 스캐너 헤드의 바닥 부분을 음향 결합을 위해 물이 채워진 아크릴 탱크 (13 cm x 30 cm x 3 cm)에 잠기 게하려면 Z- 스테이지를 사용하십시오.
- 탱크 바닥 판에 직경 7cm의 이미징 창을 열고 광학 및 음향 전달을 위해 폴리에틸렌 막으로 밀봉하십시오.
- 펄스 변환기 및 오실로스코프를 사용하여 초음파 변환기에 초점을 맞 춥니 다.
- 송신 / 수신 모드에서 펄스 에코 증폭기의 이득을 24dB로 설정하십시오.
- 싱크 아웃 신호 fr 사용펄스 에코 증폭기를 트리거로 사용하고 오실로스코프를 사용하여 유리 슬라이드 (물 탱크의 바닥에서 삽입)에서 후방 산란 신호를 감지합니다.
참고 : 슬라이드에는 검정색 테이프가 붙어 있어야합니다. - Z 축을 이동하여 펄스 에코 신호의 진폭을 최대화하십시오 (오실로스코프에서 확인).
참고 : 유리판에 초점이 맞춰지면 에코의 진폭은 최대가됩니다.
- 레이저를 켜고 UST를 BNC 케이블을 사용하여 각각 24dB 고정 게인의 두 개의 앰프에 연결하십시오.
참고 : 앰프의 출력은 데이터 수집 카드 (DAQ)에 연결됩니다. - 레이저 앞에있는 포토 다이오드 (PD)의 신호를 데이터 수집 시스템의 트리거로 사용하십시오.
- AR-PAM에서 원추형 렌즈 (con.L)와 광학 응축기 (OC) 사이의 거리를 변경하여 검사 대상에서 생성 된 광 음향 신호의 진폭을 최대화하십시오 (유리 슬라이드에 검은 색 테이프가 붙음).최대 광 음향 (PA) 신호 진폭을 결정하여 광학 및 음향 초점이 공 초점인지 확인하십시오.
- 최대 PA 신호의 지연을 확인하십시오. 나중에 이것을 사용하여 데이터 수집 소프트웨어의 포커스를 확인하십시오.
- 스캐닝 헤드의 나사를 풀고 스캐닝 헤드를 수동으로 AR-PAM에서 OR-PAM으로 전환하십시오. 그런 다음 나사를 조이십시오.
- OR-PAM에서 오실로스코프에 표시된 PA 신호 진폭을 최대화하려면 초점 무색 이중 복사 (렌즈 튜브 (LT) 내부)와 광 음향 합성기 사이의 거리를 변경하십시오.
- 최대 PA 신호의 지연에 유의하십시오.
참고 : 공 초점 배열을 결정하기 위해서는 파인 튜닝이 필요합니다.
- 최대 PA 신호의 지연에 유의하십시오.
- 횡 해상도 및 영상 깊이 정량화
- 직경 100 nm의 금 나노 입자를 사용하여 AR의 횡 방향 해상도를 결정합니다.d OR 시스템.
- 동량의 물로 0.1 mL의 나노 입자 용액을 희석한다. 희석 된 용액 0.1 mL를 커버 슬립에 분배하고 탱크 아래의 폴리에틸렌 멤브레인과 접촉시킨다.
- 스캐닝 (단계 2.8 및 2.10) 전에 AR-PAM 및 OR-PAM이 데이터 수집 소프트웨어 (재료 표 참조)에 포커스가 있는지 확인하십시오.
참고 : 2.9 및 2.10 단계에서 샘플링 속도 (250 MS / s)를 곱한 최대 PA 신호의 마이크로 초 지연을 알면 이미지가 데이터 수집 소프트웨어에서 초점을 맞 춥니 다. 데이터 수집 중에 생략해야하는 지연은 후 처리를 위해 필요한 데이터 포인트 만 저장하도록 소프트웨어에서 결정될 수 있습니다. - AR-PAM의 스캔 파라미터를 설정하고 "스캔"버튼을 눌러 래스터 스캔을 시작합니다.
- 데이터 수집 소프트웨어의 AR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 "속도"에서 "4"mm / s 스캐닝 속도로 설정합니다.; 탭, "펄스 반복 속도"탭에서 "1"kHz, "Y- 스캔 범위"탭에서 "0.5"mm, "X- 스캔 범위"탭에서 "0.5"mm. "dx"탭에서 x 방향의 스텝 크기를 "4"μm로 설정하십시오.
참고 : y 방향의 스텝 크기는 스테이지의 스캔 속도 속도와 펄스 반복률 (이 경우 4,000 μm / 1,000 Hz = 4 μm)에서 자동으로 결정됩니다.
- 데이터 수집 소프트웨어의 AR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 "속도"에서 "4"mm / s 스캐닝 속도로 설정합니다.; 탭, "펄스 반복 속도"탭에서 "1"kHz, "Y- 스캔 범위"탭에서 "0.5"mm, "X- 스캔 범위"탭에서 "0.5"mm. "dx"탭에서 x 방향의 스텝 크기를 "4"μm로 설정하십시오.
- OR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 설정하고 "스캔"버튼을 눌러 래스터 스캔을 시작하십시오.
- "속도"탭의 "2.5"mm / s 스캐닝 속도, "펄스 반복 속도"탭의 "5"kHz, "Y- 스캔 범위"탭의 "0.5"mm에서 데이터 수집 소프트웨어의 스캔 매개 변수를 설정하십시오. 탭, "X- 스캔 범위"탭에서 "0.5"mm. "dx"탭에서 x 방향의 스텝 크기를 "0.5"μm로 설정하십시오.
참고 : sy 방향의 tep 크기는 스테이지의 스캔 속도 속도와 펄스 반복 속도 (이 경우 2,500 μm / 5,000 Hz = 0.5 μm)로부터 자동으로 결정됩니다.
- "속도"탭의 "2.5"mm / s 스캐닝 속도, "펄스 반복 속도"탭의 "5"kHz, "Y- 스캔 범위"탭의 "0.5"mm에서 데이터 수집 소프트웨어의 스캔 매개 변수를 설정하십시오. 탭, "X- 스캔 범위"탭에서 "0.5"mm. "dx"탭에서 x 방향의 스텝 크기를 "0.5"μm로 설정하십시오.
- 스캔하는 동안 데이터가 지속적으로 캡처되어 컴퓨터에 저장되는지 확인하십시오.
참고 : 데이터는 Y 스테이지의 한 방향으로 만 캡처됩니다. - 컴퓨터에 저장된 다중 B- 스캔 데이터를 사용하여 이미지 처리 소프트웨어 ( 표 2 참조)를 사용하여 최대 진폭 투영 (MAP) 이미지를 검색합니다.
- 스캐닝의 단일 나노 입자 이미지 (여러 이미지 중 하나)를 사용하여 나노 입자 이미지의 중앙 영역을 가로 지르는 선을 수동으로 플롯하여 횡 방향 해상도를 결정하여 가우스 곡선과 같은 점 분산 기능을 얻습니다. 그림 2를 참조하십시오.
- Gau를 사용하여 단일 나노 입자 이미지에서 얻은 점 분산 함수를 맞추십시오.이미지 보정 소프트웨어 ( 표 2 참조)를 사용하여 반값 폭 (FWHM)을 측정합니다. 이것을 가로 해상도로 사용하십시오. 그림 2를 참조하십시오.
- 깊이 이미징의 대상 개체로 얇게 썬 닭고기 조각에 검은 테이프 조각을 비스듬히 삽입합니다. 테이프가있는 티슈를 물 탱크에 넣으십시오.
참고 : 검은 테이프는 조직에 테이프를 부착하는 데 도움이되는 날카로운 팁이있는 금속판에 붙어 있습니다. - AR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 데이터 수집 소프트웨어에 설정 한 다음 "스캔"버튼을 눌러 단일 B- 스캔 이미지를 캡처하여 최대 이미징 깊이를 결정합니다.
- "속도"탭에서 "15"mm / s 스캔 속도, "펄스 반복 속도"탭에서 "1"kHz, "Y 스캔 범위"탭에서 "5"cm, "0.1" "mm" "X- 스캔 범위"탭에서. 세트그는 "dx"탭에서 "0.1"mm에서 x 방향의 스텝 크기를 나타냅니다.
- OR-PAM의 스캔 매개 변수를 설정하고 "스캔"버튼을 눌러 단일 B- 스캔 이미지를 캡처하여 최대 이미징 부서를 결정합니다.
- "속도"탭에서 "15"mm / s 스캔 속도, "펄스 반복 속도"탭에서 "5"kHz, "Y- 스캔 범위"에서 "2"cm로 데이터 수집 소프트웨어의 스캔 매개 변수를 설정하십시오. 탭과 "X- 스캔 범위"탭에서 "0.1"mm. "dx"탭에서 x 방향의 스텝 크기를 "0.1"mm로 설정하십시오.
참고 : X- 스캔 범위와 dx는 동일하므로 하나의 B- 스캔 만 캡처됩니다. 연조직 (1,540m / s)에서의 소리의 속도를 곱한 시간 분해 PA 신호는 A- 라인 이미지를 제공합니다. B- 스캔을 생성하기 위해 Y- 스테이지의 연속 동작 중에 여러 개의 A- 라인이 캡처됩니다.
- "속도"탭에서 "15"mm / s 스캔 속도, "펄스 반복 속도"탭에서 "5"kHz, "Y- 스캔 범위"에서 "2"cm로 데이터 수집 소프트웨어의 스캔 매개 변수를 설정하십시오. 탭과 "X- 스캔 범위"탭에서 "0.1"mm. "dx"탭에서 x 방향의 스텝 크기를 "0.1"mm로 설정하십시오.
- 생체 내 </ em> 마우스 귀 혈액 혈관계 영상
- 몸무게가 25g이고 4 주령의 암컷 마우스를 사용하십시오.
- 복강 내 투여 된 ketamine (120 mg / kg)과 xylazine (16 mg / kg)의 칵테일 (0.1 mL / 10 g의 복용량)을 사용하여 동물을 마취.
- 제모 크림을 사용하여 동물의 귀에서 머리카락을 제거하십시오. 청소 부분을 닦으십시오. 흩어져있는 레이저 빔이 눈에 떨어지는 것을 방지하기 위해 멸균 된 안구 연고로 동물의 눈을가립니다.
- 귀를 위치시키는 소형 플레이트가있는 무대에 동물을 배치하십시오.
- 촬영 기간 동안 흡입 된 isoflurane (1L / min 산소에서 0.75 %)로 마취를 유지하십시오.
- 맥박 산소 측정기를 마우스 다리 또는 꼬리에 고정시키고 생리적 상태를 모니터하십시오. 이미징 영역이 초음파 젤을 사용하여 폴리에틸렌 막과 접촉하도록하십시오.
- AR-PAM의 스캔 파라미터를 설정하고 "스캔"버튼을 눌러 래스터 스캔을 시작합니다ing.
- 데이터 수집 소프트웨어의 AR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 "속도"탭에서 "15"mm / s 스캐닝 속도, "펄스 반복률"탭에서 "1"kHz, "펄스 반복 속도"탭에서 "10" Y- 스캔 범위 "탭에서"6mm "를 선택합니다. "dx"탭에서 x 방향의 스텝 크기를 "30"μm로 설정하십시오.
참고 : y 방향의 스텝 크기는 스테이지의 스캔 속도 속도와 펄스 반복 속도 (이 경우 15,000 μm / 1,000 Hz = 15 μm)로부터 자동으로 결정됩니다.
- 데이터 수집 소프트웨어의 AR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 "속도"탭에서 "15"mm / s 스캐닝 속도, "펄스 반복률"탭에서 "1"kHz, "펄스 반복 속도"탭에서 "10" Y- 스캔 범위 "탭에서"6mm "를 선택합니다. "dx"탭에서 x 방향의 스텝 크기를 "30"μm로 설정하십시오.
- AR-PAM 스캔을 완료 한 후, 이미징 헤드 위치를 AR-PAM에서 OR-PAM으로 전환하십시오 (2 절에서 설명).
- OR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 설정하고 "스캔"버튼을 눌러 래스터 스캔을 시작하십시오.
- "15"mm / s 스캔 속도로 데이터 수집 소프트웨어의 OR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 "속도「Y- 스캔 범위」탭의 「10 mm」, 「X- 스캔 범위」탭의 「6」mm의 순서로 「스텝」사이즈를 설정합니다. "dx"탭에서 x 방향으로 "6"μm로 표시됩니다.
참고 : y 방향의 스텝 크기는 스테이지의 스캔 속도 속도와 펄스 반복 속도 (이 경우 15,000 μm / 5,000 Hz = 2 μm)로부터 자동으로 결정됩니다.
- "15"mm / s 스캔 속도로 데이터 수집 소프트웨어의 OR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 "속도「Y- 스캔 범위」탭의 「10 mm」, 「X- 스캔 범위」탭의 「6」mm의 순서로 「스텝」사이즈를 설정합니다. "dx"탭에서 x 방향으로 "6"μm로 표시됩니다.
- 컴퓨터에 저장된 여러 B- 스캔 데이터를 사용하여 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 MAP 이미지를 검색합니다.
- 전체 이미징 기간 동안 동물을 관찰하십시오.
3. 실험 단계
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Representative Results
AR-OR-PAM 시스템의 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. 이 설정에서 모든 구성 요소는 광학 케이지 설정에서 통합되고 조립되었습니다. 케이지 시스템을 사용하면 AR-OR-PAM 스캐닝 헤드를 소형으로 만들 수 있으며 단일 조립 단계로 쉽게 조립, 정렬 및 통합 할 수 있습니다.
이미지 획득 중에 이미징 헤드의 2 차원 연속 래스터 스캐닝이 사용되었습니다. 시간 - 분해 된 PA 신호는 소리의 속도 (1,540 m / s)로 곱해 져서 A- 라인을 얻습니다. Y- 스테이지의 연속 동작 중에 캡처 된 여러 개의 A- 라인은 2 차원 B- 스캔을 생성했습니다. 이미징 영역의 여러 B- 스캔을 캡처하여 컴퓨터에 저장하고 MAP 광 음향 이미지를 처리하고 생성하는 데 사용되었습니다.
전환 가능한 시스템의 해상도를 결정하려면단일 나노 입자의 MAP 영상이 사용되었다. 이미지의 중앙 횡 방향을 따른 광 음향 진폭을 플롯하여 가우스 함수에 맞추었다. Gaussian fit의 FWHM은 측면 해상도로 간주됩니다. AR-PAM의 측정 된 횡 방향 해상도는 그림 2 a 와 같이 45 μm입니다. 유사하게, OR-PAM을 사용하여 얻은 단일 나노 입자 이미지는 그림 2b 와 같이 OR-PAM의 해상도를 결정하기 위해 중앙의 가로 방향으로 맞추어졌다. 측정 된 횡 방향 해상도는 FWHM으로 결정된 4 μm이었다. 그림의 삽입 그림은 금 나노 입자의 해당 MAP 이미지를 보여줍니다. 이론적으로 AR-PAM에 대한 광학 회절 한계 횡 방향 해상도는 다음 방정식을 사용하여 결정된 45 μm입니다. 0.72λ / NA, λ는 중앙 음향 파장, NA는 숫자초음파 트랜스 듀서의 구멍. 이론적 인 해상도는 실험 데이터와 잘 일치합니다. 비슷하게, OR-PAM의 이론적 인 횡 방향 해상도는 다음 식으로 계산하면 2.6 μm입니다. 0.51λ / NA, λ는 레이저 파장, NA는 대물 렌즈의 개구 수입니다. OR-PAM에 대한 실험적으로 측정 된 횡 방향 해상도는 파면 수차로 인한 회절 한계 추정보다 좋지 않습니다. AR과 OR 모두 유사한 변환기와 음향 렌즈를 사용하기 때문에 이론적 인 축 해상도는 0.88 c / Δ f 에 따라 30 μm가 될 것입니다. 여기서 c 는 연조직에서의 소리의 속도이고 Δ f 는 초음파 변환기의 주파수 대역폭입니다 . 또한, 측면 해상도는 OR-PAM ( 20) 및 AR-PAM ( 32) 모두에 대해 축 방향을 따라 변할 것이다. 여기에보고 된 횡 방향 해상도는 초점면에 있습니다.
그림 3a 는 닭고기 조직에 검은 테이프의 사진을 보여줍니다. 단일 B- 스캔 이미지는 AR-PAM과 OR-PAM을 사용하여 캡처되었습니다. 그림 3b 및 그림 3c는 각각 AR-PAM 및 OR-PAM의 단일 B- 스캔 PA 이미지를 보여줍니다. 그림 3b 에서 알 수 있듯이 AR-PAM 시스템은 검은 색 테이프를 조직 표면 아래 ~ 7.8mm까지 명확하게 묘사 할 수 있습니다. 마찬가지로 OR-PAM 시스템을 사용하여 조직 표면 아래 ~ 1.4mm까지 검은 색 테이프를 명확하게 촬영할 수있었습니다 ( 그림 3c ). 신호 대 잡음비 (SNR)도 이미지로부터 결정되었습니다. SNR은 V / n 으로 정의되며, 여기서 <em> V는 peak-to-peak PA 신호 진폭이고 n 은 배경 소음의 표준 편차입니다. 4.6mm 및 7.8mm 이미징 깊이에서 측정 된 SNR은 각각 2.6 및 1.4입니다. OR-PAM의 경우, 1.4mm 이미지 깊이의 SNR은 1.4입니다. 전환 가능한 AR-OR PAM 시스템의 생물학적 이미징 기능을 입증하기 위해 생체 내 혈관 조영 이미징을 마우스 귀에 수행했습니다. 이미징에 사용 된 살아있는 마우스 귀의 혈관 조직을 보여주는 사진이 그림 4a 에 나와 있습니다. AR-PAM을 사용하여 10mm x 6mm 스캔 영역을 촬영했으며 Y 방향으로 15um, X 방향으로 30um의 스텝 크기로 촬영했습니다. 영상 촬영을 완료하는 데 10 분이 걸렸습니다. 현재, 이미징 시스템은 한 방향으로 만 데이터를 수집합니다. 프로그램을 양방향 데이터 수집 기능을 갖도록 수정하여 획득 시간을 거의 절반으로 줄일 수 있습니다. 그림 4 는 AR-PAM의 MAP 이미지를 보여줍니다.b . 관심 영역의 클로즈업은 그림 4c에 나와 있습니다. OR-PAM을 이용하여 Y 방향으로 3㎛, X 방향으로 6㎛의 스텝 크기로 스캔 된 유사한 영역이도 4d에 도시되어 있다 . 영상 촬영을 완료하는 데 46 분이 걸렸습니다. 관심 영역의 클로즈업은 그림 4e에 나와 있습니다. OR-PAM은 AR-PAM이 해결할 수없는 단일 모세 혈관을 명확하게 해결할 수 있습니다. AR-PAM은 45μm보다 두꺼운 용기를 분해 할 수 있습니다.
요약하면, 단단한 광학 집속을 이용하는 고해상도 이미징을 달성 할 수있는 스위칭 가능한 AR-OR-PAM 시스템뿐만 아니라 음향 집속을 사용하는 심 조직 이미징이 개발되었습니다. 전환 가능한 AR-OR-PAM 시스템의 성능은 측방 해상도 및 영상 깊이 측정을 사용하여 정량화되었습니다. 생체 내 스터드또한 생물학적 이미징 능력을 보여주기 위해 수행되었습니다. 이 전환 형 광 음향 현미경 시스템은 높은 시간적 및 공간적 해상도를 제공하여 심혈관 질환뿐만 아니라 이미징 단일 모세 혈관이 중요한 혈관 신생, 약물 반응 등의 영상을 포함하는 응용 분야에 시스템을 중요하게 만듭니다. 홈 메이드 스위처 블 플레이트를 10cm 이동 모터 스테이지 (y- 축)로 교체하면 시스템을 더욱 개선하거나 개선 할 수 있습니다. OR-PAM의 횡 방향 해상도는 파면 수차를 보정함으로써 더욱 향상 될 수 있습니다. AR-PAM에 더 높은 펄스 에너지를 전달하면 SNR과 이미징 깊이도 향상됩니다.
OR-PAM의 경우, 광학 초점이 생체 내 이미징을 위해 피부 표면 아래 150 μm라고 가정하면, 표면 스폿 크기는 직경 22.5 μm입니다. 90 nJ의 단일 레이저 펄스를 전송하면 ma가됩니다.20.4 mJ / cm2의 최빈 펄스 에너지. AR-PAM의 경우, 레이저 초점은 직경 2mm입니다. 50 μJ의 단일 레이저 펄스를 제공하면 ANSI 안전 한계 인 20 mJ / cm2 , 33 내에서 1.6 mJ / cm2의 초점에서 최대 펄스 에너지를 제공합니다.
그림 1 : AR-OR-PAM 이미징 시스템의 도식. PD : 광 다이오드, CL : 집광 렌즈, PH : 핀홀, FC : 광 커플러, UST : 초음파 변환기, MMF : 다중 모드 광섬유, SMF : 단일 모드 광섬유, DAQ : 데이터 수집 카드, TS : 변환 스테이지, Con.L : 원뿔 렌즈, L1 : 볼록 렌즈, L2 & L3 : 무색 렌즈, RA : 직각 프리즘, RP : 마름모 프리즘, OC : 광학 응축기, M : mirror, SP : 슬립 플레이트, LT : 렌즈 튜브, TM : 변환 마운트, KMM :기구 학적 거울 마운트, AL : 음향 렌즈. ( b ) 프로토 타입 AR-OR-PAM 시스템의 사진. ( c ) 광 자기 빔 결합기의 근접. ( d ) 중앙에 UST가있는 광학 응축기의 근접. 허락을 받아 참조 34 에서 증쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : AR-OR-PAM 시스템의 측면 분해능 테스트 : 직경 100 nm의 금 나노 입자를 이미지화하여 측 해상도를 측정했습니다. 검은 점 (*) : 광 음향 신호; 청색 선 : ( a ) AR-PAM 및 ( b )OR-PAM. 삽입 된 그림은 단일 금 나노 입자의 (a)와 (b)의 OR-PAM 이미지의 대표적인 AR-PAM 이미지를 보여줍니다. 허락을 받아 참조 34 에서 증쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 이미징 깊이 측정 : 단일 B- 스캔 닭의 조직에 비스듬히 삽입 된 검은 테이프의 PA 이미지. ( a ) 개략도. ( b ) AR-PAM 이미지. ( c ) OR-PAM 이미지. 허락을 받아 참조 34 에서 증쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 마우스 귀의 In Vivo Photoacoustic 이미지 : ( a ) 마우스 귀 혈관의 사진. (b) AR-PAM 이미지. ( c ) 흰색 점선으로 표시된 것처럼 ( b )의 관심 영역 클로즈업 (ROI). ( d ) OR-PAM 이미지. ( e ) ( d )의 관심 영역 (ROI) (흰색 점선으로 표시) ( f ) 단일 모세 혈관을 보여주는 (e)의 ROI 흰 선의 클로즈업 이미지. 허락을 받아 참조 34 에서 증쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
결론적으로, 낮은 이미징 깊이에서 고해상도 이미징과 높은 이미징 깊이에서 저해상도 이미징을 모두 수행 할 수있는 전환 가능한 AR 및 OR PAM 시스템이 개발되었습니다. 전환 가능한 시스템의 측 해상도와 영상 깊이가 결정되었습니다. 이 전환 가능한 PAM 시스템의 장점은 다음과 같습니다. (1) 엄격한 광학 초점을 사용하는 고해상도 이미징. (2) 음향 집속을 이용한 심 조직 영상; 3) 강력한 PA 신호가 피부 표면에 나타나는 것을 방지하는 AR-PAM의 암시 야 조명. 4) 서로 다른 시스템 사이에서 샘플을 옮기지 않고 한 장소에 샘플을 보관할 수있는 능력. 5) 다중 레이저 및 스캐닝 스테이지의 사용을 피할 수있는 가능성; 6) 수제 성분의 최소 사용. 이것은 샘플 / ob을 움직이지 않고 동일한 샘플의 고해상도, 얕은 깊이 이미지 및 저해상도, 심 조직 이미지를 제공하는 OR-PAM과 암시 야 AR-PAM의 최초보고 된 조합입니다ject. 동일한 스캐닝 스테이지와 레이저를 사용하면 시스템을 효율적이고 비용 효율적으로 사용할 수 있습니다. 결합 된 시스템은 1.4 mm 이미징 깊이의 4 μm 횡 방향 해상도와 7.8 mm 이미징 깊이의 45 μm 횡 해상도를 제공합니다. 이 시스템은 최소한의 수제 구성 요소가있는 광학 케이지 시스템으로 만들어져있어 AR과 OR PAM을 쉽게 조합, 정렬 및 전환 할 수 있습니다. 결합 된 스캐닝 헤드는 소형이며 단일 스캐닝 단계에서 쉽게 조립할 수 있습니다. 결합 된 시스템을 사용하여 생체 내 이미징이 성공적으로 입증되었습니다.
개발 된 시스템은 전임상 이미징에 사용될 수 있습니다. 주요 전임상 응용에는 혈관 신생, 종양 미세 환경, 미세 순환, 약물 반응, 뇌 기능, 바이오 마커 및 유전자 활동의 영상이 포함됩니다. 시스템의 한계에는 스캔 시간이 포함됩니다. 현재 긴 스캔 시간이 필요하지만 봇의 데이터를 수집하여 줄일 수 있습니다h 방향. OR-PAM과 AR-PAM 간의 동시 이미지 수집은 현재 불가능합니다. 현재 OR-PAM과 AR-PAM 사이의 수동 전환이 필요합니다. 이는 적어도 10cm Y 방향 이동이있는 이동 스테이지를 사용하여 피할 수 있습니다. 프로토콜의 중요한 단계에는 광학 및 음향 초점의 공 초점 결정이 포함됩니다. OR-PAM의 광학 스폿 크기가 5 μm 미만이고 단일 모세 혈관을 이미지화하는 것; AR-PAM을위한 OR-PAM 및 광학 콘덴서 용 광 음향 빔 결합기의 설계에 관한 것이다.
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Disclosures
모든 동물 실험은 싱가포르 남양 기술 대학교 (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 된 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 저자는 원고에 관련있는 금전적 이해 관계가없고 공개 할 다른 잠재적 인 이해 상충은 없다.
Acknowledgments
저자는 싱가포르 교육부 (ARC2 / 15 : M4020238)에서 후원하는 Tier 2 교부금에 대한 재정 지원을 인정하고자합니다. 저자는 Machine Shop의 도움을 주신 Chow Wai Hoong Bobby에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
References
- Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. J Biomed Opt. 15, 011101-01-011101-15 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nat Methods. 13, 627-638 (2016).
- Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V.
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S. K., Pramanik, M. Recent Developments in Vascular Imaging Techniques in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. BioMed Res Intl. 2015, (2015).
- Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales. Neurophotonics. 1 (1), 011003-1-011003-13 (2014).
- Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic Tomography: In Vivo Imaging from Organelles to Organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
- Beard, P.
- Pan, D. Molecular photoacoustic imaging of angiogenesis with integrin-targeted gold nanobeacons. FASEB J. 25 (3), 875-882 (2011).
- Cai, X., Kim, C., Pramanik, M., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of foreign bodies in soft biological tissue. J Biomed Opt. 16 (4), 046017 (2011).
- Pan, D. Near infrared photoacoustic detection of sentinel lymph nodes with gold nanobeacons. Biomaterials. 31 (14), 4088-4093 (2010).
- Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photon. 3 (9), 503-509 (2009).
- Zhang, E. Z., Laufer, J. G., Pedley, R. B., Beard, P. C. In vivo high-resolution 3D photoacoustic imaging of superficial vascular anatomy. Phys. Med. Biol. 54 (4), 1035-1046 (2009).
- Park, S., Lee, C., Kim, J., Kim, C. Acoustic resolution photoacoustic microscopy. Biomed.l Eng. Lett. 4 (3), 213-222 (2014).
- Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).
- Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. In vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopy. Opt Lett. 30 (6), 625-627 (2005).
- Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215 (2016).
- Kim, J. Y., Lee, C., Park, K., Lim, G., Kim, C. Fast optical-resolution photoacoustic microscopy using a 2-axis water-proofing MEMS scanner. Sci Rep. 5, 07932 (2015).
- Matthews, T. P., Zhang, C., Yao, D. K., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic microscopy of peripheral nerves. J Biomed Opt. 19 (1), 016004 (2014).
- Hai, P., Yao, J., Maslov, K. I., Zhou, Y., Wang, L. V.
- Danielli, A.
- Zhang, C. Reflection-mode submicron-resolution in vivo photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 17 (2), 020501 (2012).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt Lett. 36 (7), 1134-1136 (2011).
- Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
- Upputuri, P. K., Krishnan, M., Pramanik, M. Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study. J Biomed Opt. 22, 045001 (2017).
- Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study. J Biomed Opt. 19 (11), 116003 (2014).
- Allen, T. J. Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al. Proc SPIE. , 97080W (2016).
- Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle. Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).
- Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution. Laser Phys Lett. 11 (4), 045601 (2014).
- Jeon, S., Kim, J., Kim, C. In vivo switchable optica- and acoustic - resolution photoacoustic microscopy. Proc SPIE. , 970845 (2016).
- Song, W. Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo. Sci Rep. 6, 32240 (2016).
- Park, J., et al. Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10 (2016).
- ANSI Standard Z136.1-2000. American National Standard for Safe Use of Lasers. , NY. (2000).
- Moothanchery, M., Pramanik, M. Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System. Sensors. 17 (2), 357 (2017).
