الببتيد والبروتين القياس الكمي باستخدام الآلية المناعية-استخدام (إيمالدي)
Summary
ويرد على بروتوكول لتحديد كمية البروتين في السوائل البيولوجية المعقدة باستخدام التكنولوجيا الآلية المناعية-استخدام (إيمالدي).
Abstract
الطيف الكتلي (مللي ثانية) واحدة من التكنولوجيات الأكثر استخداماً لتحديد كمية البروتينات في عينات معقدة، مع خصوصية المقايسة ممتازة نتيجة للكشف عن نسبة الكتلة إلى تهمة كل جزيء الهدف المباشر. بيد البروتيوميات المستندة إلى مرض التصلب العصبي المتعدد، مثل معظم غيرها من التقنيات التحليلية، وقد تحيز نحو قياس تحليلها وفرة عالية، ولذلك فإنه يمثل تحديا لتحقيق الكشف عن حدود منخفضة نانوغرام/مل أو بيكوغرام/مل في عينات معقدة، وهذا هو نطاق التركيز للعديد البروتينات ذات الصلة بالمرض في بيوفلويدس مثل البلازما البشرية. للمساعدة في الكشف عن تحليلها وفرة منخفضة، أدمجت المقايسة للتركيز وتنقية أكثر قبل قياس مرض التصلب العصبي المتعدد، وإلى حد كبير تحسين حساسية المقايسة المناعية لتخصيب. في هذا العمل، هو التكنولوجيا ماتريكساسيستيد الليزر الامتزاز/التأين (إيمالدي) المناعية-قدمت للتحديد الكمي للبروتينات والببتيدات في بيوفلويدس، استناداً إلى التخصيب المناعية على الخرز، متبوعاً بقياس استخدام MS دون شطف مسبق. الأجسام المضادة الببتيد فونكتيوناليزيد على حبات مغناطيسية، والمحتضنة مع العينات. بعد الغسيل، الخرز يتم نقلها مباشرة على استخدام لوحة هدف، ويتم قياس الإشارات باستخدام وقت الرحلة (استخدام-TOF) الصك بعد تطبيق الحل مصفوفة الخرز. يتم تبسيط إجراءات إعداد عينة مقارنة بغيرها فحوصات المناعية-مرض التصلب العصبي المتعدد، وقياس استخدام سريع. إعداد نموذج كامل الآلي مع سائل التعامل مع النظام، مع إمكانية تكرار نتائج الفحص المحسنة وإنتاجية أعلى. في هذه المقالة، يستخدم الإنزيم إيمالدي لتحديد انجيوتنسين الببتيد أنا (إنج أنا) تركيز في البلازما، الذي يستخدم سريرياً كقراءات نشاط إنزيم الرينين في البلازما لفحص الدوستيرونيسم الأولية (السلطة الفلسطينية).
Introduction
الكتلي أصبحت أداة لا غنى عنها في البروتيوميات الكمية. الكتلي يمكن تحديد الجماهير المستهدفة البروتينات أو الببتيدات، ولذلك إشارات أكثر التي تم الحصول عليها يمكن أن تكون محددة للغاية مقارنة بتحديدكم. طريقتين التأين، اليكتروسبراي، واستخدام، هي الأكثر شيوعاً للكشف عن البروتينات والببتيدات1،2،،من34. تحديا كبيرا في تحديد مقدار البروتين المستندة إلى MS يكمن في الكشف عن البروتينات المنخفضة-وفرة في العينات المعقدة في تركيزات نانوغرام/مليلتر أو pg/mL حضور وفرة عالية البروتينات، والعديد من المؤشرات الحيوية البروتين المرشح وجدت في البلازما البشرية ضمن هذا النطاق5. هو سبب هذه المشكلة إلى حد كبير بدينامية طبيعتها واسعة النطاق والتعقيد من البروتين البشري6.
للتغلب على هذه التحديات الكشف، تطورت الأساليب المناعية-مرض التصلب العصبي المتعدد لإثراء البروتينات المستهدفة أو الببتيدات من الحلول العينة على سطح صلب، تليها شطف تحليلها ومرض التصلب العصبي المتعدد قياس7،8 , 9 , 10-من خلال تخصيب المناعية، يتم تنقيته تحليلها من العينات المعقدة وذلك يتم الحد من آثار أيون-قمع من الجزيئات الأخرى. بين مختلف يدعم الصلبة، الخرز المغناطيسي حاليا أكثر تستخدم على نطاق واسع كما لها مزايا القدرة الملزمة جسم العالية وسهولة التعامل. أعدت حبات مغناطيسية مع فونكتيوناليزيشنز مختلفة وأحجام وتسويقها للتجارب إيمونوبريسيبيتيشن. وحتى الآن، تم ربطه المناعية-الإثراء على الخرز مع اليكتروسبراي التأين (ESI) واستخدام MS لقياس البروتين والببتيد. في معايير النظائر المستقرة واستيلاء التكنولوجيا الببتيد المضادة الأجسام المضادة (سيسكابا)، يتم هضمها البروتينات في العينات، تليها الحضانة مع الخرز المغلفة بالأجسام المضادة المناعية-الإثراء. في سيسكابا “الكلاسيكية”، الببتيدات بروتيوتيبيك القبض على الوتيد من الخرز، ويقاس بالسائل اللوني-ESI-مرض التصلب العصبي المتعدد (LC-MS)، أو عن طريق التسريب المباشر11،ESI-متعددة “رد فعل” الرصد–مرض التصلب العصبي المتعدد (أي إس أي-الآلية-MS)12. تحسين المناعية لتخصيب حساسية المقايسة الآلية 3-4 للحجم، الوصول إلى النطاق المنخفض نانوغرام/مل13.
بالمقارنة مع اليكتروسبراي–مرض التصلب العصبي المتعدد، استخدام–مرض التصلب العصبي المتعدد هو أسرع، ولا تنطوي على التنظيف وإعادة الموازنة LC الأعمدة حتى تكون هناك أي قضايا التلوث وترحيل، يجعلها أكثر ملاءمة للدراسات الفائق14. وقد وضعت المناعية-استخدام التكنولوجيا في المختبر للجمع بين المناعية لتخصيب باستخدام MS للقياس الكمي حساسة ومحددة من الببتيدات والبروتينات (استناداً إلى كوانتيتيشن الببتيدات بروتيوتيبيك)15،16 ،17. بعد تخصيب المناعية، تودع الخرز على لوحة هدف استخدام مصفوفة الحل هو إضافة إلى الخرز واللوحة جاهز للتحليل باستخدام-TOF-MS بعد التجفيف. لا يتم شطف الببتيدات من الخرز كخطوة منفصلة، ولكن يتم التيد تحليلها زمنياً تقارب باستخدام مصفوفة الحل عند إضافته إلى بقع حبة، وبالتالي تبسيط إعداد العينة والتقليل إلى أدنى حد من الخسائر في عينة. التكنولوجيا إيمالدي قد طبقت في مجموعة متنوعة من التطبيقات18،19، ومؤخرا تم الآلي واستخدامه لقياس انجيوتنسين أنا (إنج أنا) لتحديد البلازما إنزيم الرينين النشاط (PRA)20. سوف يثبت هذا البروتوكول الإجراء المستخدم للقيام تحليل الآلي إيمالدي. أخذ مقايسة جيش الخلاص الشعبي على سبيل مثال، السير الذاتية اليوم بين أقل من 10% قد تحققت من خلال التشغيل الآلي للمكاتب، مع القدرة على قياس العينات 744 كل يوم20.
والرزن جيش الخلاص الشعبي إيمالدي أظهر في هذه المخطوطة لا يتطلب هضم البروتين، الجزيء المستهدف (إنج أنا) ببتيد مع وزن الجزيئي دا 1295.7. في فحوصات أخرى حيث هضم البروتين ضروري وببتيد كالمركب للبروتين سليمة، ينبغي أن يكون الببتيد مختارة إيمالدي الفريدة والمحددة للبروتين المستهدفة، مع كتلة عبر 800 دا حتى أنه يمكن تمييزها بسهولة من c الكيماوية من الضوضاء من استخدام مصفوفة الحل. الببتيد المضادة الأجسام المضادة مطلوبة من أجل المناعية-إثراء الببتيدات. البروتوكول المتعلق بفحص إيمالدي قياس جيش الخلاص الشعبي يتكون من أربع خطوات: 1) جيل إنج في البلازما البشرية؛ 2) المناعية-الإثراء إنج الأول باستخدام الخرز المغلفة بالأجسام المضادة؛ 3) نقل الخرز إلى استخدام لوحة الهدف وإضافة مصفوفة الحل؛ و 4) إشارة شراء بتحليل البيانات واستخدام-TOF-MS20.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقارنة لتحديد مقدار البروتين التقليدية المستندة إلى مرض التصلب العصبي المتعدد، يستخدم إيمالدي الأجسام المضادة لإثراء تحليلها وتنقية لها من العينات المعقدة، ولذلك يجعل من الممكن تحديد كمية البروتينات أو الببتيدات تركيزات منخفضة. هو خطوة حاسمة في البروتوكول إيمالدي المناعية-إثراء الببت…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدعم المالي من الجينوم كندا وكولومبيا البريطانية الجينوم للعمليات (204PRO)، وتطوير التكنولوجيا (214PRO) من خلال شبكة الابتكارات الجينوم (الجن). ونشكر “برنامج اكتشاف المخدرات” في معهد البحوث التابع لجامعة ماكجيل المركز الصحي لاستخدام أداة TOF استخدام لتصوير. H.L. تشعر بالامتنان للدعم من زمالة ما بعد الدكتوراه من “الوطنية للعلوم” والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة). C.H.B تشعر بالامتنان للدعم من صندوق الهبات الرائدة (الليف). C.H.B. تشعر بالامتنان للدعم من الرئاسة ماكغيل سيغال في “علم الأورام الجزيئي” في جامعة ماك غيل (مونتريال، كيبيك، كندا). M.X.C. و C.H.B. ممتنة للدعم من مؤسسة الأسرة سيغال ألفين وارن Y. سوبر الخيرية الصندوق الاستئماني إلى “المستشفى العام اليهودي” (مونتريال، كيبيك، كندا).
Materials
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
Riferimenti
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
- Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. . Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).
- Yergey, A. L., et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).
- Anderson, L. Six decades searching for meaning in the proteome. J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).
- Landegren, U., et al. Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis. Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate. Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).
- Fredolini, C., et al. Immunocapture strategies in translational proteomics. Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).
- Tran, J. C., et al. Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies. Anal. Chem. , (2016).
- Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow. N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).
- Razavi, M., et al. High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).
- Anderson, N. L., et al. SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device. Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).
- Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. Mass-spectrometry-based clinical proteomics – a review and prospective. The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).
- Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).
- Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II. Methods. 56 (2), 213-222 (2012).
- Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension. Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).
- Jiang, J., et al. Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis. Proteomics Clin Appl. 1, (2007).
- Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis. Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).
- Popp, R. An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).
- Schoenherr, R. M., et al. Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry. J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , (2011).
- Weiß, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).
- Nelson, A. L. Antibody fragments: Hope and hype. mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).
- Gupta, V., et al. An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein. Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).
