ペプチドおよびタンパク質定量を使用して自動免疫-MALDI (iMALDI)
Summary
自動免疫 MALDI (iMALDI) 技術を使用して複雑な体液でプロテインの定量のためのプロトコルが表示されます。
Abstract
質量分析 (MS) は、各ターゲット分子の質量電荷比の直接検出の結果として優秀なアッセイの特異性と複雑な試料中のタンパク質を定量化するための最も一般的に使用される技術の一つです。しかし、他のほとんどの分析技術のような MS ベースのプロテオミクスは高豊富な検体を測定への偏り、検出限界は低い ng/mL のまたは pg/mL で複雑なサンプル、およびこれは多くの濃度範囲を達成するために困難ですのでひと血漿など生体の疾患関連蛋白質。低豊富な検体の検出を支援するには、免疫強化を集中し、MS の測定、アッセイの感度が大幅に向上する前に検体を浄化するアッセイに統合されています。この作品で、免疫-マトリックス レーザー脱離イオン化 (iMALDI) 技術がタンパク質及びペプチドの生体の定量化のために提示はビーズに免疫強化に基づく、事前の溶出なし MALDI MS 測定が続きます。抗ペプチド抗体は磁気ビーズの官能基化、サンプルと孵化させます。洗浄後、ビーズは MALDI ターゲット プレート上に直接転送し、マトリックス ソリューションがビーズに適用された後、飛行 (MALDI-TOF) 計器の MALDI 時間は信号を測定します。その他免疫 MS の試金に比較サンプルの準備の手順を簡略化し、MALDI の測定は高速。改善された分析の再現性と高スループット処理システム、液体全体サンプル準備が自動化されます。この記事で iMALDI 試金はペプチド アンジオテンシンを決定するため使用される私 (Ang 私) 原発性アルドステロン症 (PA) のスクリーニングのため血漿レニン活性の読み出しとして臨床的に使用されている血漿中濃度。
Introduction
質量分析法による定量的プロテオミクスにおける必要不可欠なツールとなっています。質量分析法は、ターゲット蛋白質またはペプチッドの固まりを判断できます、したがって得られた試料信号することができます非常に具体的イムノアッセイと比較しています。エレクトロ スプレーと MALDI は、2 つのイオン化方法は、タンパク質・ ペプチド1,2,3、4を検出するためによく使用されます。MS を用いたタンパク質定量における大きな課題は、高豊富な蛋白質の存在下で ng/mL または pg/mL の濃度で複雑な試料中の低豊富なタンパク質の検出、ひと血漿中発見多く候補蛋白質バイオ マーカーこれの範囲の5を実行します。この問題は、本質的に広いダイナミック レンジおよび人間の proteome6の複雑さが主原因です。
ターゲット蛋白質または固体表面上にサンプル ソリューションからペプチドを豊かにする方法が免疫 MS 検出課題を克服するために開発されて、検体と MS 測定7,8の溶出順,9,10します。 複雑なサンプルから濃縮、免疫を介して、検体を精製し、他の分子からイオン抑制効果を最小化するため。固体の様々 なサポートの中では、扱いやすさと高い抗体結合能力の利点を有するので磁気ビーズは最も広く使用現在。別の functionalizations とサイズの磁気ビーズを開発し、免疫沈降実験のため商品化します。日には、ビーズに免疫強化をエレクトロ スプレー イオン化 (ESI) と MALDI MS タンパク質およびペプチドの測定のためインターフェースされてが。安定同位体標準および抗ペプチド抗体 (SISCAPA) 技術による捕獲は、免疫強化のための抗体をコートしたビーズと孵化によって続いて、試料中のタンパク質は消化されます。「古典的な」SISCAPA でキャプチャ proteotypic ペプチドが、ビーズから溶出し、測定による液体クロマトグラフィー-MS (LC-MS)、または直接注入 ESI 複数反応モニタリング MS (ESI MRM MS)11,12。免疫強化は、ng/mL の低範囲13に達する 3-4 桁 MRM アッセイ感度を向上します。
エレクトロ スプレー MS と比較して、MALDI MS の高速、かつを含まない洗浄と LC カラムの再平衡持ち越しと汚染の問題がないのでより高スループット研究14に適しています。ペプチッドおよび蛋白質 (proteotypic ペプチドの定量に基づく) の特異的かつ高感度定量 MALDI MS と免疫強化を結合する当研究室で開発した免疫 MALDI 技術15,16 ,17。免疫濃縮後 MALDI ターゲット プレートにビーズを堆積、マトリックス ソリューション ビーズに追加されます、乾燥後プレートは MALDI TOF MS による分析の準備ができて。ビーズからペプチドの溶出は別のステップとして実行されませんが、アフィニティ バインド analytes は MALDI のマトリックス ソリューションによって溶離されるビード スポット、サンプル準備を簡素化し、サンプルの損失を最小限に抑えることに追加するとき。IMALDI 技術適用されているさまざまなアプリケーション18,19で、最近自動化されアンジオテンシンを測定するために使用私 (Ang 私) 血漿レニン活性 (PRA)20を決定します。このプロトコルは、自動 iMALDI 分析を実行するための手順を説明します。例については、10% 未満の間日 CVs としてプラ アッセイを取って日20あたり 744 のサンプルを測定する機能を備えた、自動化によって達成されています。
本稿で示した iMALDI プラ アッセイはターゲット分子としてのタンパク質消化を必要としない (アン私) 1295.7 Da の分子量のペプチドです。C とそれを簡単に区別できるように 800 Da 以上の質量を持つ、ターゲット蛋白質に固有にする必要があります iMALDI の選択したペプチドその他試金蛋白質消化が必要あり、ペプチドはそのまま蛋白質の代理として使用される、MALDI のマトリックス ソリューションから 2・3 のノイズ。抗ペプチド抗体、ペプチドの免疫強化に必要です。PRA を測定 iMALDI 試金のためのプロトコルは 4 つのステップで構成されています: 1) アンの世代人間プラズマで2) 免疫-豊かなアンの私は抗体をコートしたビーズ; を使用して3) ビーズの MALDI ターゲット プレートと追加するマトリックス ソリューションへの転送・ 4) 信号集録 MALDI TOF MS とデータ解析20。
Protocol
Representative Results
Discussion
従来の MS を用いたタンパク質定量と比較して、iMALDI は、分析検体を豊かにし、したがって、それはタンパク質またはペプチド低濃度を定量化することが可能、複雑なサンプルからそれらを浄化する抗体を使用します。IMALDI プロトコルの重要なステップは、ターゲット ペプチドの免疫強化です。このため、高い特異性と親和性の抗体を選択してください。SISCAPA、内 10-9 M 以上で抗体?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ゲノム技術革新ネットワーク (ジン) をゲノム カナダ、操作 (204PRO) および技術開発 (214PRO) のゲノム ブリティッシュ コロンビア州からの資金援助に感謝いたします。撮影用飛行時間測定器の使用のマギル大学健康センター研究所薬剤発見プラットフォームをありがちましょう。H.L. 国立科学工学研究協議会のカナダ (レベル) からポスドク研究員プログラムからサポートに感謝です。C.H.B は最先端基金基金 (葉っぱ) からのサポートに感謝しています。えざるはマギル大学 (モントリオール, ケベック州, カナダ) 分子腫瘍学のシーガル マギル椅子からのサポートに感謝します。M.X.C. とえざるがユダヤ人の総合病院 (モントリオール, ケベック州, カナダ) にウォーレン Y. ソーパー慈善信託とアルヴィン シーガル家族財団から支援に感謝。
Materials
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
Riferimenti
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