펩 티 드 및 단백질 정량화를 사용 하 여 자동 면역-MALDI (iMALDI)
Summary
자동된 면역-MALDI (iMALDI) 기술을 사용 하 여 복잡 한 생물 학적 체액에서 단백질 정량화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.
Abstract
질량 분석 (MS)는 각 대상 분자의 질량 대 전 비의 직접적인 탐지 결과로 우수한 시험으로 복잡 한 견본에서 단백질을 측정에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 기술 중 하나입니다. 그러나, 대부분의 다른 분석 기법 처럼 MS 기반 proteomics, 높은 풍부 analytes 측정으로 편견을가지고, 그래서 그것을 달성 하기 위해 도전 검색 낮은 ng/mL의 제한 또는 복잡 한 예제 및 이것에서 pg/mL은 많은 농도 범위 biofluids 인간 플라스마 등에서 질병 관련 단백질. 낮은 풍부한 analytes의 검색에서을 돕기 위해, 면역 강화에 집중 하 고 순화 MS 측정, 시험 감도 크게 향상 하기 전에 분석 분석 결과 통합 되었습니다. 이 작품에서는, 면역 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화 (iMALDI) 기술은 단백질과 펩 티 드 biofluids에의 정량화에 대 한 제시, 구슬에 면역-농축에 따라, 사전 차입 없이 MALDI MS 측정 뒤. 안티 펩 티 드 항 체는 자성 구슬에 기능성 고 샘플 incubated. 세척, 구슬 MALDI 표적 격판덮개에 직접 전송 됩니다 후 신호 매트릭스 솔루션 구슬에 적용 된 후 MALDI 시간의 비행 (TOF MALDI) 악기에 의해 측정 됩니다. 샘플 준비 절차는 다른 면역 MS 분석 실험에 비해 간소화 하 고 MALDI 측정은 빠르다. 전체 샘플 준비 향상 된 분석 결과 재현성 및 높은 처리량 처리 시스템, 액체 자동입니다. 이 문서에서는, iMALDI 분석 결과 펩 티 드 안을 결정 하는 데 사용 되 나 (중앙 나) 기본 aldosteronism (PA)의 심사에 대 한 플라즈마 renin 활동의 판독으로 임상으로 사용 되는 플라즈마에 농도.
Introduction
질량 분석 양적 proteomics에 불가 결 한 도구가 되고있다. 질량 분석 대상 단백질 또는 펩 티 드의 질량을 확인할 수 있습니다, 그리고 따라서 취득된 분석 신호 수 있습니다 매우 구체적인 immunoassays에 비해. 2 개의 이온화 방법, 분무 및 MALDI, 가장 일반적으로 단백질 및 펩 티 드1,2,,34를 탐지 하는 데 사용 됩니다. MS 기반 단백질 정량화의 주요 과제는 높은 풍부한 단백질의 ng/mL 또는 pg/mL 농도에서 복잡 한 샘플에 낮은 풍부한 단백질의 검출에 거짓말 그리고 인간 플라스마에서 발견 많은 후보 단백질 바이오 마커 내이 범위5. 이 문제는 대부분 본질적으로 넓은 동적 범위와 인간 프로테옴6의 복잡성에 의해 발생 됩니다.
극복 하기 위해 이러한 탐지 과제, 면역 MS 방법은 대상 단백질 또는 펩 티 드 고체 표면에 샘플 솔루션에서 풍부 하 게 개발 되었다 뒤에 analytes과 MS 측정7,8 의 차입 , 9 , 10. 면역 강화 통해는 analytes 복잡 한 샘플에서 순화 된다 그리고 다른 분자에서 이온 억제 효과 최소화 하는 따라서. 다양 한 고체 지원 중 자석 구슬은 현재 가장 널리 사용으로 높은 항 체 바인딩 용량의 장점 및 취급의 용이성. 마그네틱 구슬 다른 functionalizations와 크기를 개발 하 고 immunoprecipitation 실험에 대 한 상용화 되었습니다. 날짜 하려면, immuno-농축 구슬에는 되었습니다 인터페이싱 분무 이온화 (ESI)과 MALDI MS 단백질 및 펩 티 드 측정에 대 한. 안정 동위 원소 표준 및 안티 펩 티 드 항 체 (SISCAPA) 기술에 의해 캡처, 샘플에서 단백질 소화는, 면역 강화에 대 한 항 체 코팅 구슬 부 화 뒤. “클래식” SISCAPA에서 캡처된 proteotypic 펩 티 드, 구슬에서 eluted 있으며 측정 하 여 액체 착 색 인쇄기-ESI-석사 (LC-석사), 또는 직접적인 주입 ESI-다중 반응 모니터링-석사 (ESI-MRM-석사)11,12. 면역-농축 향상 MRM 분석 결과 감도 3-4 배나 낮은 ng/mL 범위13도달.
분무 MS에 비해, MALDI MS 빠릅니다, 그리고 포함 하지 않는 청소 및 LC 열의 재 평형 carryover 및 오염 문제가 없습니다 그래서 높은 처리량 연구14를 위해 더 적당 한 만들기. 와 결합 하 여 면역-농축 MALDI MS 펩 티 드와 단백질 (proteotypic 펩 티 드의 정량 기준)의 과민 하 고 특정 정량화에 대 한 우리의 실험실에서 면역 MALDI 기술 개발 되었습니다15,16 ,17. 면역-농축 후 구슬 MALDI 표적 격판덮개에 예금 하 고 매트릭스 솔루션 구슬에 추가 하 고 접시 건조 후 MALDI TOF MS 분석에 대 한 준비가 되어. 구슬에서 펩 티 드의 차입 별도 단계로 수행 되지 않습니다 하지만 선호도 바인딩된 analytes는 eluted MALDI 매트릭스 솔루션에 의해 비드 관광 명소, 그로 인하여 시료 준비를 단순화 하 고 샘플 손실 최소화에 추가 되 면. IMALDI 기술 다양 한 애플 리 케이 션18,19에 적용 된 및 최근에 자동화 되었으며 안 측정에 사용 되 나 (중앙 난) 플라즈마 renin 활동 (PRA)20결정. 이 프로토콜은 자동된 iMALDI 분석 결과 수행 하는 데 사용 하는 절차를 시연할 예정 이다. 예를 들어, 10% 미만의 간 날 CVs 프라 분석 결과 복용 하루20당 744 샘플 측정 기능으로 자동화를 통해 달성 되었습니다.
이 원고에서 iMALDI PRA 분석 결과 대상 분자로 단백질 소화를 요구 하지 않는다 (중앙 나) 1295.7 Da의 분자 무게 펩 티 드 이다. 다른 분석 실험 단백질 소화 필요 하 고 펩 티 드 그대로 단백질 대리로 사용 되에서 iMALDI에 대 한 선택 된 펩타이드 독특하고 800 다 그래서 그는 c에서 쉽게 구별 될 수 있다 이상의 질량을 가진 대상 단백질에 특정 해야 MALDI 매트릭스 솔루션에서 hemical 잡음입니다. 안티 펩 티 드 항 체는 면역 강화는 펩 티 드에 대 한 필요 합니다. PRA를 측정 하는 iMALDI 분석 결과 대 한 프로토콜 4 단계로 구성: 1) 중앙의 세대 나 인간의 플라즈마; 2) 중앙의 면역-농축 항 체 코팅 구슬;를 사용 하 여 나 3) 이전 비즈는 MALDI 표적 격판덮개 추가 매트릭스 솔루션; 그리고 4) MALDI TOF MS 및 데이터 분석20수집을 신호.
Protocol
Representative Results
Discussion
기존의 MS 기반 단백질 정량화에 비해, iMALDI는 analytes 풍부 하 고 따라서 단백질 또는 펩 티 드 낮은 농도에서 정할 수 있도록 복잡 한 샘플에서 그들을 정화 하 항 체를 사용 합니다. IMALDI 프로토콜에 중요 한 단계는 대상 펩 티 드의 면역 농축입니다. 이 목적에 대 한 선호도와 높은 특이성 항 체를 선택 합니다. SISCAPA에서 그것은 10-9 M 또는 더 나은에서 항 체 친 화력 낮은 ng/mL2…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 게놈 캐나다와 게놈 브리티시 컬럼비아 (204PRO) 운영 및 기술 개발 (214PRO)에 대 한 재정 지원을 게놈 혁신 네트워크 (진)을 통해 감사합니다. 우리는 촬영 MALDI TOF 악기의 사용에 대 한 맥 길 대학 건강 센터의 연구소에서 약물 검색 플랫폼을 감사합니다. H.L. 국가 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC)에서 박사 후 친목에서 지원에 대 한 감사입니다. C.H.B 감사 지원을 위해 앞 가장자리 기부금 펀드 (LEEF)에서 이다. C.H.B. 맥 길 대학 (몬트리올, 퀘 백, 캐나다)에서 분자 종양학 시걸 맥 길의 자에서 지원에 대 한 감사입니다. M.X.C.와 C.H.B.는 유태인 종합 병원 (몬트리올, 퀘 백, 캐나다)에 워렌 Y. Soper 자선 신탁 및 앨빈 시걸 가족 재단에서 지원에 대 한 감사.
Materials
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
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