Peptid ve Protein miktar kullanarak otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI)
Summary
Otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI) teknolojisini kullanarak karmaşık biyolojik sıvı protein miktar için bir protokol sunulmuştur.
Abstract
Kütle spektrometresi (MS) her hedef molekül kütlesi ücret oranı doğrudan tespiti sonucunda mükemmel tahlil özgüllük ile karmaşık örnekleri, protein miktarının için en sık kullanılan teknolojileri biridir. Ancak, çoğu diğer analitik teknikler gibi MS tabanlı proteomik yüksek-bereket analitler ölçme doğru bir önyargı var, elde etmek zor bu yüzden düşük ng/mL algılama sınırlar veya pg/mL karmaşık örnekleri ve bu konsantrasyon aralığın çoğu için biofluids insan plazma gibi hastalık ilgili proteinleri verdik. Düşük-bereket analitler algılama içinde yardımcı olmak için IMMUNO-zenginleştirme konsantre ve MS ölçüm, önemli ölçüde tahlil duyarlılık geliştirmek önce analit arındırmak için tahlil içine entegre edilmiştir. Bu çalışmada, IMMUNO – Matrix-Assisted lazer desorpsiyon/iyonlaşma (iMALDI) teknoloji proteinlerin ve peptidler biofluids içinde miktar için sunulan, IMMUNO-zenginleştirme boncuk üzerinde temel alan, maldı-MS ölçüm öncesinde elüsyon olmadan izledi. Anti-peptid antikorlar manyetik boncuklar functionalized ve örnekleri ile inkübe. Sonra yıkama, boncuk doğrudan bir maldı hedef tabağa aktarılır ve matris çözüm için boncuk uygulandıktan sonra sinyalleri tarafından uçuş (MALDI-TOF) enstrümanın bir maldı-zaman ölçülür. Diğer IMMUNO-MS deneyleri için karşılaştırıldığında örnek hazırlama prosedürü Basitleştirilmiş ve maldı ölçüm hızlıdır. Bütün numune hazırlama sistemi, geliştirilmiş tahlil tekrarlanabilirlik ve yüksek işlem hacmi ile işleme bir sıvı ile otomatik olarak gerçekleşir. Bu makalede, iMALDI tahlil peptid anjiyotensin belirlemek için kullanılır ben (Ang ben) konsantrasyon plazma, plazma renin aktivitesi okuma birincil aldosteronism (PA) tarama için klinik olarak kullanılır.
Introduction
Kütle spektrometresi nicel proteomik içinde vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Kütle spektrometresi hedef proteinler veya peptidler kitlelerin belirlemek için bu nedenle elde edilen analit sinyalleri uzun için karşılaştırıldığında çok özel olabilir. İki iyonlaşma yöntemleri, electrospray ve maldı, en çok1,2,3,4proteinler ve peptidler algılamak için kullanılır. Düşük-bereket proteinler yüksek-bereket proteinler huzurunda ng/mL veya pg/mL konsantrasyonlarda karmaşık örneklerinde tespiti MS tabanlı protein miktar içinde büyük bir sorun yatıyor ve insan plazmada bulunan birçok aday protein biyolojik vardır Bu aralığı5içinde. Bu sorun büyük ölçüde doğal olarak geniş dinamik alan ve insan Proteom6karmaşıklığı tarafından nedeniyle oluşur.
Bu algılama zorlukları aşmak için IMMUNO-MS yöntemleri hedef proteinler veya katı bir yüzeye örnek çözümlerinden peptidler zenginleştirmek için geliştirilmiştir analitler ve MS ölçüm7,8 elüsyon tarafından takip , 9 , 10. IMMUNO-zenginleştirme karmaşık örnekleri analitler saflaştırılmış ve bu nedenle diğer molekülleri iyon-bastırma etkilerinden en aza indirilir. Sahip oldukları yüksek antikor Bağlama kapasitesi avantajları ve kullanım kolaylığı gibi çeşitli katı destekler arasında manyetik boncuklar şu anda en yaygın olarak kullanılmaktadır. Farklı functionalizations ve boyutları ile manyetik boncuklar geliştirilen ve immunoprecipitation deneyler için ticari. Bugüne kadar IMMUNO-zenginleştirme boncuk üzerinde electrospray iyonlaşma (ESI) ve maldı-MS ile protein ve peptid ölçüm için sızdı. Kararlı izotop standartları ve yakalama tarafından Anti-peptid antikorlar (SISCAPA) teknolojisi, kuluçka antikor kaplı boncuk IMMUNO-zenginleştirme ile takip örnekleri proteinleri sindirmek. “Klasik” SISCAPA içinde ele geçirilen proteotypic peptidler boncuk eluted ve tarafından sıvı Kromatografi-ESI-MS (LC-MS) veya doğrudan infüzyon ESI-çoklu tepki izleme-MS (ESI-MRM-MS)11,12tarafından ölçülür. IMMUNO-zenginleştirme MRM tahlil duyarlılığı düşük ng/mL Aralık13ulaşan 3-4 büyüklük, geliştirilmiş.
Electrospray-MS için karşılaştırıldığında, maldı-MS daha hızlı ve böylece hiçbir ertelenmiş ve kirlenme sorunları, temizlik ve LC sütunların yeniden denge yüksek üretilen iş çalışmaları14için daha uygun hale anlamına gelmez. IMMUNO-maldı teknoloji bizim laboratuvar IMMUNO-zenginleştirme maldı-MS ile hassas ve belirli miktar peptidler ve proteinler (proteotypic peptidler Nefelometri üzerinde dayalı) için birleştirmek için geliştirilen15,16 ,17. IMMUNO-zenginleştirme sonra boncuk maldı hedef tabağa yatırılır, matris çözüm için boncuk eklenir ve plaka kuruduktan sonra bir MALDI-TOF-Bayan göre analiz için hazırdır. Boncuk üzerinden peptidler elüsyon ayrı bir adım olarak gerçekleştirilir, ancak böylece numune hazırlama basitleştirilmesi ve örnek kaybını en aza boncuk noktalarına eklendiğinde benzeşme bağlı analitler maldı matris çözüm tarafından eluted. İMALDI teknoloji uygulamaları18,19, çeşitli uygulanan ve son zamanlarda edilmiş otomatik ve anjiyotensin ölçmek için kullanılan ben (Ang ben) plazma renin aktivitesi (PRA)20belirlemek için. Bu iletişim kuralı bir otomatik iMALDI tahlil gerçekleştirmek için kullanılan yordam gösterecektir. Örnek olarak, daha az % 10 arası gün CVs PRA tahlil alarak sağlanmıştır edildi 744 örnek gün20/ ölçme yeteneği ile otomasyon yoluyla.
Bu el yazması gösterdi iMALDI PRA tahlil hedef molekül olarak protein sindirimi gerektirmez (Ang ben) bir peptid 1295.7 Da Moleküler ağırlığı olduğunu. Diğer deneyleri içinde nerede protein sindirimi gereklidir ve bir peptid için olduğu gibi protein vekil olarak kullanılır, eşsiz ve bunun c kolayca ayırt edilebilir böylece 800 Da üzerinde bir kitle ile hedef protein iMALDI için seçili peptid olmalıdır Hemical gürültü maldı matris çözümden. Anti-peptid antikorlar peptidler IMMUNO-zenginleştirme için gereklidir. İletişim kuralı PRA ölçme bir iMALDI tahlil için dört adımlardan oluşur: 1) Ang nesil ben insan plazma; 2) IMMUNO-zenginleştirme Ang I istimal boncuk antikor kaplı; 3) boncuk bir maldı hedef plaka ve transfer ekleyerek matris çözüm; ve 4) sinyal Alım bir MALDI-TOF-MS ve veri analizi20tarafından.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geleneksel MS tabanlı protein miktar için karşılaştırıldığında, iMALDI analitler zenginleştirmek ve onları karmaşık örnekleri, bu nedenle proteinler veya düşük konsantrasyonlarda peptidler ölçmek mümkün hale gelen arındırmak için antikorlar kullanır. İMALDI Protokolü kritik bir adımda hedef peptidler immün zenginlik olduğunu. Bu amaçla, antikorlar yüksek özgüllük ve ilgi ile seçilmesi gerekir. SISCAPA, 10-9 M veya daha iyi, antikor benzeşim düşük ng/mL…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Genom yenilikler ağ (cin) aracılığıyla mali destek genom Kanada ve genom British Columbia işlemleri (204PRO) ve teknoloji geliştirme (214PRO) için teşekkür ederiz. İlaç keşif platformu Araştırma Enstitüsü McGill Üniversitesi Sağlık Merkezi için filme MALDI-TOF enstrüman kullanımı için teşekkür ediyoruz. H.L. desteği Ulusal Bilim ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) bir doktora sonrası bursu dan minnettardır. C.H.B öncü bağış Fonu (LEEF) üzerinden destek için minnettar olduğunu. C.H.B. desteği (Montreal, Quebec, Kanada) McGill Üniversitesi’nde moleküler Onkoloji Segal McGill sandalyeden minnettardır. M.X.C. ve C.H.B. Yahudi Genel Hastanesi (Montreal, Quebec, Kanada) için Warren Y. Soper hayırsever güven ve Alvin Segal Aile Vakfı çekmek için minnettarız.
Materials
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
Riferimenti
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
- Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. . Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).
- Yergey, A. L., et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).
- Anderson, L. Six decades searching for meaning in the proteome. J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).
- Landegren, U., et al. Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis. Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate. Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).
- Fredolini, C., et al. Immunocapture strategies in translational proteomics. Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).
- Tran, J. C., et al. Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies. Anal. Chem. , (2016).
- Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow. N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).
- Razavi, M., et al. High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).
- Anderson, N. L., et al. SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device. Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).
- Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. Mass-spectrometry-based clinical proteomics – a review and prospective. The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).
- Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).
- Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II. Methods. 56 (2), 213-222 (2012).
- Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension. Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).
- Jiang, J., et al. Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis. Proteomics Clin Appl. 1, (2007).
- Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis. Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).
- Popp, R. An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).
- Schoenherr, R. M., et al. Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry. J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , (2011).
- Weiß, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).
- Nelson, A. L. Antibody fragments: Hope and hype. mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).
- Gupta, V., et al. An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein. Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).
