Modélisation de toxicité amyloïde-β42 et neurodégénérescence dans le cerveau de poisson-zèbre adulte
Summary
Ce protocole décrit la synthèse, la caractérisation et injection de peptides de monomère amyloïde-β42 pour générer les toxicité amyloïde dans adult poisson zèbre à établir un modèle de la maladie d’Alzheimer, suivi d’analyses histologiques et détection de agrégations.
Abstract
La maladie d’Alzheimer (ma) est une maladie neurodégénérative quelle accumulation d’amyloïde toxique-β42 des peptides (Aβ42) mène à la dégénérescence synaptique, l’inflammation, la mort neuronale débilitante et déficits d’apprentissage. Les humains ne peut pas régénérer les neurones perdus dans le cas de l’AD en partie en raison de la capacité de prolifération réduite des cellules souches/progénitrices neurales (NSPC) et réduit la neurogenèse. Par conséquent, thérapies régénératives efficaces devraient également accroître la prolifération et neurogène de NSPC. Zebrafish (Danio rerio) est un organisme régénératrice, et nous pouvons apprendre les programmes moléculaires fondamentales avec laquelle nous pourrions concevoir approches thérapeutiques pour lutter contre les AD. Pour cette raison, la génération d’un modèle AD-comme chez le poisson zèbre était nécessaire. En utilisant notre méthodologie, nous pouvons introduire synthétiques dérivés du peptide Aβ42 avec capacité de pénétration tissulaire dans le cerveau adulte poisson-zèbre et analyser la pathologie de la maladie et la réponse régénératrice. L’avantage sur les méthodes existantes ou des modèles animaux est que ce poisson zèbre peut nous apprendre comment un cerveau vertébré peut régénérer naturellement et ainsi nous aider à traiter les maladies neurodégénératives humaines mieux en ciblant les NSPC endogène. Par conséquent, le modèle amyloïde-toxicité dans le cerveau du poisson-zèbre adulte peut ouvrir de nouvelles avenues pour la recherche dans le domaine des neurosciences et de la médecine clinique. En outre, l’exécution simple de cette méthode permet d’évaluation expérimentale rentable et efficace. Ce manuscrit décrit la synthèse et l’injection de peptides Aβ42 dans le cerveau du poisson-zèbre.
Introduction
AD est une maladie chronique caractérisée par la perte des neurones et de synapses dans le cortex cérébral1,2,3,4,5. Les caractéristiques neuropathologiques de la maladie classiques de publicité sont les dépôts de peptides amyloïdes et formation de la neurofibrillaire embrouillent (NFTs)6. Les plaques séniles, également connu sous le nom de plaques amyloïdes, sont composés de peptides amyloïdes-β (Aβ) qui forment des structures β-plissées dans le parenchyme de cerveau5. L’accumulation de Aβ42 dans Alzheimer joue un rôle critique et début dans la progression de la maladie. AD déclenche une cascade d’événements conduisant à la dysfonction synaptique, plasticité avec facultés affaiblies et perte neuronale7,8,9,10.
Le cerveau adulte des téléostéens poisson zèbre sert un excellent modèle pour étudier la régulation de la plasticité des cellules souches11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 et diverses maladies dans le système nerveux central (CNS), y compris AD21,22,23 ,,24. Grâce à une vaste gamme de méthodes expérimentales disponibles19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, ces études sont informatifs et réalisable. Poisson zèbre peut reconstituer le CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, en partie à l’aide de programmes moléculaires activés après la perte neuronale19,39,40,41,42,43, 44. Par conséquent, établissant un modèle de maladie neurodégénérative chez le poisson zèbre peut aider à poser des questions nouvelles concernant la biologie régénératrice de capacité et de cellules souches dans les cerveaux vertébrés.
Récemment, nous avons développé un modèle de toxicité amyloïde dans le cerveau du poisson-zèbre adulte en injectant synthétique Aβ42 peptides (tableau 1)39. Cette injection causé des phénotypes de neurodégénérescence réminiscent de la pathologie du cerveau humain (p. ex., la mort cellulaire, activation microgliale, dégénérescence synaptique et les déficits de mémoire), indiquant que poisson zèbre peut être utilisée pour susciter neurodégénérescence dans le cerveau du poisson-zèbre, Aβ42 peptides peuvent être détectées avec salissures immunohistochimiques et mécanismes moléculaires de la régénération chez le poisson zèbre adulte, que CNS peut être identifié39. Dans ce protocole, nous démontrons l’injection de synthétiques peptides amyloïdes dans le cerveau de poisson-zèbre à l’aide d’un cérébroventriculaire injection (CVMI) méthode27,39,45,46 pour imiter le dépôt amyloïde (Figure 1). CVMI propose une nouvelle façon d’offrir les peptides, qui agrègent à injection en tant que structures feuillet β et exercer une toxicité. Les peptides sont réparties uniformément dans tout le cerveau, en ciblant la zone ventriculaire le long de l’ axe rostro-caudal ensemble45. En outre, cette méthode permet pour analyser la réponse morphologique et moléculaire de la NSPC dans le cerveau adulte poisson zèbre suite des inclusions amyloïdes. Ces études nous donnera un aperçu de la réparation du cerveau réussie chez les mammifères. Notre méthode peut être utilisée pour comprendre le mécanisme moléculaire nécessaire d’une réponse de régénération réussie après AD-comme des symptômes d’induire la reconstitution des neurones perdus et la récupération fonctionnelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les peptides amyloïdes peuvent être modifiés pour inclure les variations de séquence ou les différentes balises. Par exemple, un peptide bêta-amyloïde brouillé peut être généré, et les peptides peuvent être marqués avec des étiquettes fluorescentes à la N-terminale de la fin de peptide ou transporteur peptides39le tag. De même, dans le présent protocole, le peptide de transporteur est la pénétration cellulaire peptide TR en raison de son efficacité pour transport marchandise p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le DZNE et l’Association Helmholtz (VH-NG-1021), CRDT, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) et Dia (KI1524/6) (C.K.) ; et par la Communauté Leibniz (scie-2011-gif-2) et le BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Nous tenons également à remercier Ulrike Hofmann pour la synthèse de peptide et à Nandini Asokan et Prayag Murawala Elly Tanaka pour aide pendant le tournage de la procédure.
Materials
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
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