Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme
Summary
Bu iletişim kuralı sentezi, karakterizasyonu ve monomeric amiloid-β42 peptidler amiloid toksisite histolojik analizler ve tespiti takip bir Alzheimer hastalığı modeli kurmak için yetişkin Zebra balığı üretme için enjeksiyon açıklar toplamalardan.
Abstract
Alzheimer hastalığı (Ah) bir toksik amiloid-β42 hangi birikimi (Aβ42) peptidler açar sinaptik bozulma, iltihap, nöronal ölüm nörodejeneratif hastalık zayıflatıcı, açıkları öğrenme ‘s. İnsanlar reklam durumunda kayıp nöronlar kısmen sinir kök/progenitor hücreler (NSPCs) ve düşük neurogenesis Engelli proliferatif kapasitesi nedeniyle yeniden olamaz. Bu nedenle, verimli rejeneratif terapiler de yayılması geliştirmek gerekir ve Nörojenik NSPCs. Zebra balığı (Danio rerio) kapasitesini rejeneratif bir organizmadır ve temel moleküler programlar hangi ile biz tasarım olabilir öğrenebilirsiniz Reklam mücadele için tedavi yaklaşımları. Bu nedenle, Zebra balığı bir reklam gibi modelinde nesil gerekliydi. Bizim metodoloji kullanarak, biz Aβ42 peptid sentetik türevleri doku delici kabiliyetine sahip yetişkin Zebra balığı beynine tanıtmak ve hastalık patoloji ve rejeneratif yanıt analiz. Mevcut yöntemler veya hayvan modelleri üzerinde o Zebra balığı nasıl omurgalı bir beyin doğal olarak yeniden ve böylece insan nörodejeneratif hastalıklar daha iyi endojen NSPCs hedefleyerek tedavisi için bize yardımcı bize öğretebilir avantajdır. Bu nedenle, Yetişkin Zebra balığı beyinde kurulan amiloid-toksisite modeli Nörobilim ve klinik tıp alanında araştırma için yeni yollar açılabilir. Ayrıca, bu yöntem basit yürütülmesi için maliyet-etkin ve verimli deneysel değerlendirme sağlar. Bu el yazması sentezi ve Aβ42 peptidler kod Zebra balığı beyin içine ekleme açıklar.
Introduction
Reklam nöronlar kaybı ile karakterize kronik ilerleyici bir hastalıktır ve serebral korteks1,2,3,4,5‘ te synapses. Reklam klasik neuropathological işaretlerinden amiloid peptidler birikimi vardır ve neurofibrillary oluşumu (NFTs)6ipliği. Senil plaklar, olarak da bilinen amiloid plaklar, β-Pileli yapıları içinde beyin parankimi5formu amiloid-β (Aβ) peptidler oluşur. Aβ42 birikimi reklam hastalarda, hastalığın ilerlemesinde erken ve kritik bir rol vardır. Sinaptik fonksiyon bozukluğu, Engelli plastisite ve nöronal kayıp7,8,9,10önde gelen olaylar bir çağlayan reklam tetikler.
Teleost Zebra balığı yetişkin beyin düzenleme kök hücre plastisite11,12,13,14,15, , eğitim için mükemmel bir model hizmet veren 16,17,18,19,20 ve21,yılında22,23 de dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi (MSS), çeşitli hastalıklarda ,24. Kullanılabilir deneysel yöntemleri19,20,25,26,27,28,29, geniş bir dizi sayesinde 30 , 31, bu çalışmalar bilgilendirici ve uygulanabilir. Zebra balığı CNS13,15,32,33,34,35,36,37doldurmak, kısmen aktif nöron kaybı19,39,40,41,42,43sonra, moleküler programları kullanarak, 38, 44. Bu nedenle, nörodejeneratif hastalık modeli içinde Zebra balığı kurulması omurgalı beynindeki rejeneratif yeteneği ve kök hücre biyolojisi ile ilgili yeni soruları adresine yardımcı olabilir.
Son zamanlarda, sentetik Aβ42 peptidler (Tablo 1)39enjekte edilerek yetişkin Zebra balığı beyin amiloid toksisite modelinde geliştirdik. Bu enjeksiyon neden ateş fenotipleri (örneğin, hücre ölümü, mikroglial harekete geçirmek, sinaptik bozulma ve bellek açıkları), insan beyninin patolojinin anımsatan Bu Zebra balığı-ebilmek var olmak kullanılmış için alabilme gösteren ateş Zebra balığı beyinde peptidler immunohistokimyasal stainings ve rejenerasyon CNS olabilir yetişkin Zebra balığı olarak moleküler mekanizmaları ile tespit edilebilir Aβ4239tespit edilmiştir. Bu protokol için biz sentetik amiloid peptidler makarna bir cerebroventricular enjeksiyon (CVMI) yöntemi27,39,45,46 kullanarak Zebra balığı beyin içine enjeksiyon göstermek Amiloid birikimi (şekil 1) taklit etmek için. CVMI enjeksiyon olarak β-sayfa yapıları üzerine toplamak ve toksisite sarfetmek peptidler, teslim yeni bir yol sağlar. Peptidler45tüm rostro Kaudal eksen boyunca ventrikül alan hedefleme beyin boyunca eşit olarak dağıtılır. Ayrıca, bu yöntem amiloid kapanımlar takip yetişkin Zebra balığı beyinde NSPCs morfolojik ve moleküler yanıt analiz için sağlar. Bu tür çalışmalar bize memelilerde başarılı beyin tamir için bir fikir verecek. Bizim yöntem başarılı rejenerasyon yanıt gerekli moleküler mekanizması kayıp neurons ve fonksiyonel iyileşme ikmal ikna etmek için reklam benzeri belirtiler sonra anlamak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Amiloid peptidler sıra varyasyonları veya çeşitli Etiketler içerecek şekilde değiştirilmiş. Örneğin, şifreli amiloid peptid oluşturulabilir ve peptidler N-terminus peptid sonu itibariyle floresan etiketlerle etiketlenmiş ya da taşıyıcı peptidler39ile Etiketlenmiş. Benzer şekilde, bu protokol için taşıyıcı peptid hücre Penetran peptid TR etkinliğini nakliye kargo derin nedeniyle beyin doku39içine alınır. Ayrıca, bizim yöntem enjeksiyon ve toks…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser DZNE ve Helmholtz Derneği (VH-NG-1021), CRTD, tarafından desteklenmiştir TU Dresden (FZ-111, 043_261518) ve DFG (KI1524/6) (C.K.); ve tarafından Leibniz Derneği (SAW-2011-IPF-2) ve BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Biz de Ulrike Hofmann peptid sentez ve Nandini Asokan, Prayag Murawala ve Elly Tanaka için yordamı çekimleri sırasında yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
Riferimenti
- LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Selkoe, D. J. Alzheimer’s disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Serpell, L. C. Alzheimer’s amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
- Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer’s disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer’s disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer’s disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
- McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer’s disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
- Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer’s disease?. Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
- Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer’s disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
- Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
- Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
- Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
- Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
- Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
- Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
- Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
- Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
- Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Katz, S., et al. . Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
- Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Sewald, N., Jakubke, H. . Peptides: Chemistry and Biology. , (2009).
- Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chimica. 22 (25), 8685-8693 (2016).
- Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
- Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
- Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
- Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).
