Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Published: October 25, 2017

doi:

Prabesh Bhattarai, Alvin Kuriakose Thomas, Mehmet Ilyas Cosacak, Christos Papadimitriou, Violeta Mashkaryan, Yixin Zhang, Caghan Kizil³

¹German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, ²B CUBE, Center for Molecular Bioengineering,Technische Universität Dresden, ³Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD),TU Dresden

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese, Charakterisierung und Injektion von Monomeren Amyloid-β42 Peptide zur Erzeugung von Amyloid Toxizität in Erwachsenen Zebrafisch, eine Alzheimer-Krankheitsmodell, gefolgt von histologische Analyse und Erkennung von Aggregationen.

Abstract

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine schwächende Neurodegenerative Erkrankung in die Ansammlung der giftigen Amyloid-β42 (Aβ42) Peptide zu synaptischen Degeneration, Entzündung, neuronalen Tod führt, und Defizite zu lernen. Menschen können nicht verlorene Neuronen bei AD teilweise aufgrund eingeschränkter proliferative Kapazität der neurale Stammzellen/Vorläuferzellen (NSPCs) und reduzierte Neurogenese regenerieren. Daher effiziente regenerative Therapien dürfte auch die Verbreitung und neurogene Kapazität des NSPCs Zebrafish (Danio Rerio) ist eine regenerative Organismus, und wir können lernen, molekulare Grundprogramme mit denen wir gestalten könnte therapeutische Ansätze zur Bewältigung von AD. Aus diesem Grund war die Generation der ein AD-ähnliches Modell im Zebrafisch notwendig. Mit unserer Methodik können wir synthetische Derivate von Aβ42 Peptid mit Gewebe durchdringende Fähigkeit in das Gehirn des Erwachsenen Zebrafisch vorstellen und analysieren die Krankheit-Pathologie und die regenerative Antwort. Der Vorteil gegenüber den bestehenden Methoden oder Tiermodellen ist das Zebrafisch kann uns lehren, wie eine Wirbeltiere Gehirn natürlich regenerieren kann, und damit helfen Sie uns, menschliche Neurodegenerative Krankheiten besser zu behandeln, indem Sie auf endogene NSPCs. Daher kann das Amyloid-Toxizität-Modell im Gehirn Erwachsener Zebrafisch etabliert neue Möglichkeiten für die Forschung auf dem Gebiet der Neurowissenschaften und der klinischen Medizin öffnen. Darüber hinaus erlaubt die einfache Ausführung dieser Methode für kostengünstige und effiziente experimentelle Bewertung. Dieses Manuskript beschreibt die Synthese und Injektion von Aβ42 Peptide in Zebrafisch Gehirn.

Introduction

AD ist eine chronisch fortschreitende Erkrankung zeichnet sich durch den Verlust von Neuronen und Synapsen in der Großhirnrinde¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Klassische neuropathologische AD zeichnen die Ablagerung von Amyloid Peptide und Bildung von der neurofibrillären Verwicklungen (NFTs)⁶. Senilen Plaques, auch bekannt als Amyloid-Plaques bestehen aus Amyloid-β (Aβ) Peptide, die β-Plissee Strukturen im Gehirn Parenchym⁵zu bilden. Die Anhäufung von Aβ42 in Alzheimer-Patienten hat eine frühe und wichtige Rolle im Fortschreiten der Krankheit. Anzeige löst eine Kaskade von Ereignissen zu synaptischen Dysfunktion, beeinträchtigt Plastizität und neuronaler Verlust⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰.

Die Erwachsene Gehirn teleost Zebrafisch dient als eine ausgezeichnete Modell zur Regulierung der Stammzelle Plastizität¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰ und verschiedenen Krankheiten in das zentrale Nervensystem (ZNS), einschließlich AD²¹^,²²^,²³ ^,²⁴. Aufgrund einer Vielzahl von verfügbaren experimentellen Methoden¹⁹^,²⁰^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^, ³⁰ ^, ³¹, sind diese Studien informativ und umsetzbar. Zebrafisch kann die CNS¹³^,¹⁵^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^auffüllen, ³⁸, teilweise mit Hilfe molekularer Programme aktiviert nach neuronaler Verlust¹⁹^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^, ⁴⁴. Daher kann eine Neurodegenerative Krankheitsmodell zu etablieren, im Zebrafisch Adresse neuartige Fragen zu Fähigkeiten und die Stammzelle Regenerationsbiologie in vertebrate Gehirne helfen.

Vor kurzem, entwickelten wir ein Amyloid Toxizität in Erwachsenen Zebrafisch Gehirn durch die Injektion von synthetischem Aβ42 Peptide (Tabelle 1)³⁹. Diese Injektion verursacht Neurodegeneration Phänotypen erinnert an menschliche Gehirnpathologie (z.B., Absterben von Zellen, Mikroglia-Aktivierung, synaptischen Degeneration und Gedächtnisstörungen), darauf hinweist, dass Zebrafisch eignet sich für entlocken Neurodegeneration im Zebrafisch Gehirn identifiziert Aβ42 Peptide erkannt werden können, mit immunhistochemischen Färbungen und molekularen Mechanismen der Regeneration im Erwachsenen Zebrafisch lässt CNS³⁹. In diesem Protokoll zeigen wir Ihnen die Injektion von synthetischem Amyloid Peptide in der Zebrafisch Gehirn mittels eine Cerebroventricular Injektion (CVMI) Methode²⁷^,³⁹^,⁴⁵^,⁴⁶ Amyloid-Ablagerungen (Abbildung 1) zu imitieren. CVMI bietet eine neuartige Weise des Lieferns der Peptide, die aggregiert nach Einspritzung als β-Sheet-Strukturen und üben Toxizität. Die Peptide werden gleichmäßig im gesamten Gehirn, gezielt das ventrikuläre Gebiet entlang der gesamten Rostro-kaudalen Achse⁴⁵. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode für die Analyse der morphologischen und molekularen Reaktion des NSPCs im Erwachsenen Zebrafisch Gehirn nach Amyloid Einschlüsse. Solche Studien liefern uns einen Einblick für erfolgreiche Gehirn Reparatur bei Säugetieren. Unsere Methode kann verwendet werden, zu verstehen, die notwendig molekularen Mechanismus für eine erfolgreiche Regeneration Antwort nach AD-ähnliche Symptome, Auffüllung des verlorenen Neuronen und funktionelle Wiederherstellung zu induzieren.

Protocol

dieses Protokoll ist ein Standardverfahren, vorgeschlagen von den EU-Richtlinien (2010/63) und der European Society for Fish Modelle in Biologie und Medizin (EuFishBioMed) im Karlsruher Institut für Technologie (KIT). Alle hier beschriebene Methoden von der Ethikkommission (Landesdirektion Dresden; Belegnummer TVV-52/2015) genehmigt worden. 1. Vorbereitung der Aβ42 Peptid Synthe Peptide (siehe Tabelle 1) unter Verwendung der standard 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (F…

Representative Results

HPLC wurde verwendet, um das synthetisierte Peptid zu reinigen und Massenspektrometrie wurde verwendet, um die gereinigten Amyloid β-Peptide zu charakterisieren. Die HPLC-Säule wurde erhitzt bis zu 50 ° C, die Trennung von Aβ-Peptide zu verbessern und die Fraktionen wurden gesammelt. Um das korrekt synthetisierte Peptid zu identifizieren, wurde für alle Fraktionen Massenspektroskopie Analyse durchgeführt. UPLC Chromatogramm zeigt die Reinheit der Verbindung. Die HPLC-Fraktion, die e…

Discussion

Das Amyloid Peptide können geändert werden, um Sequenzvariationen oder verschiedenen Tags enthalten. Beispielsweise eine Rührei Amyloide-Peptid kann erzeugt werden, und die Peptide können beschriftet mit fluoreszierenden Tags am N-Terminus von Peptid-Ende oder mit dem Stichwort Träger Peptide³⁹. Ebenso ist das Träger-Peptid in diesem Protokoll der Zelle eindringen Peptid TR wegen seiner Wirksamkeit zu Transport Ladung tief in das Gehirn Gewebe³⁹. Darüber hinaus könn…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt von DZNE und die Helmholtz-Gemeinschaft (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) und DFG (KI1524/6) (c.k.); und durch die Leibniz-Gemeinschaft (SAW-2011-IPF-2) und BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z). Wir möchten auch Ulrike Hofmann für die Peptidsynthese und Nandini Asokan, Prayag Murawala und Elly Tanaka für Hilfe während der Dreharbeiten des Verfahrens danken.

Materials

Fmoc-protected amino acids	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)		Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)	RL-1030	Activator
Oxyma	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)	RL-1180	Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)	SOL-003	Base
Dimethylformamide	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)	SOL-004	Solvent
N-Methylmorpholine	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany	A12158	Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)	Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)	157260 ALDRICH	Activator
Piperidine	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	822299	Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM)	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	106050	Solvent
Formic acid (FA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	100264	Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	808260	Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS)	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	233781 ALDRICH	Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS)	Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH	34967-1L	Solvent
Acetonitrile (for HPLC)	VWR International Ltd, England	83639.320	Solvent
Diethylether	VWR International Ltd, England	23811.326	Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT)	VWR International Ltd, England	0281-25G	Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin	Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)	S30023	Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters	Intavis AG (Cologne, Germany)	34.274	Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter	Sartorius Stedtim (Aubagne, France)	11806-50-N	Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter	Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe	KC78.1	Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer	Intavis, Cologne, Germany	ResPep SL	Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC	Waters, Milford Massachusetts, USA	Waters 2998, Waters e2695	Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm	Phenomenex Ltd. Germany	00G-4328-N0	Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter	EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA	LCPAK0001	Water purification system
Filtration Unit	Sartorius Stedtim (Aubagne, France)	16307	Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector	Waters, Milford Massachusetts, USA	M09UPA 664M	Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm	Waters, Milford Massachusetts, USA	186002350	Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector	Waters, Milford Massachusetts, USA	QBB908	Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6	Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany	16706, 101542	Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader	Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)	Sigma-Aldrich	A5040
Petri dishes	Sarstedt	821.472
Phosphate-buffered saline	Life Technologies, GIBCO	10010-056
Needle	Becton-Dickinson	305178
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers	World Precision Instruments	501985
Gillies Dissecting Forceps	World Precision Instruments	501265
Glass injection capillaries	World Precision Instruments	TWF10
PicoNozzle	World Precision Instruments	5430-12
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide	Parkland Scientific	ILL-RLG
Cryostat	Leica	CM1950

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Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).