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Neuroscienze

아 밀 로이드-β42 독성 그리고 Zebrafish 두뇌에서 Neurodegeneration 모델링

Published: October 25, 2017
doi:
10.3791/56014
, , , , , ,
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering,Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD),TU Dresden

Summary

합성, 특성, 및 성인 zebrafish 조직학 분석 및 탐지 하는 Alzheimer의 질병 모델을 설정 하에 아 밀 로이드 독성을 생성 하기 위한 단위체 아 밀 로이드-β42 펩 티 드의 사출이이 프로토콜에 설명 합니다. 집계입니다.

Abstract

Alzheimer의 질병 (광고) 이며 독성 아 밀 로이드-β42의 어떤 축적에 펩 티 드 (Aβ42) 시 냅 스 변성, 염증, 신경 죽음에 이르게 하는 신경 퇴행 성 질병을 쇠 약하게 적자를 학습. 인간 신경 줄기/뿌리 세포 (NSPCs)와 감소 된 성체의 장애인된 증식 능력 때문에 광고의 경우 손실된 신경을 재생성 수 없습니다. 따라서, 효율적인 재생 치료 또한 확산을 강화 한다 neurogenic 용량의 NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) 재생 유기 체, 그리고 우리는 설계할 수 있는 기본적인 분자 프로그램을 배울 수 있는 광고를 태 클에 치료 접근입니다. 이러한 이유로, zebrafish에 광고와 같은 모델의 생성이 필요 했다. 우리의 방법론을 사용 하 여, 성인 zebrafish 뇌 조직 관통 기능 Aβ42 펩 티 드의 합성 파생 상품을 소개 하 고 질병 병 리 및 재생 응답 분석 수 있습니다 우리. 기존의 방법 또는 동물 모델에 장점은 그 zebrafish 수 우리를 가르쳐 어떻게 척추 뇌 수 자연스럽 게 재생성, 따라서 생 NSPCs를 대상으로 하 여 더 나은 인간의 신경 퇴행 성 질환을 치료 하는 데 도움이. 따라서, 성인 zebrafish 뇌에 아 밀 로이드 독성 모델의 신경 과학 및 임상 의학 분야에서 연구를 위한 새로운도 열 수 있습니다. 또한,이 방법의 간단한 실행 비용 효과적이 고 효율적인 실험 평가 대 한 수 있습니다. 이 원고는 합성 zebrafish 두뇌에 Aβ42 펩 티 드의 주입을 설명합니다.

Introduction

광고 뉴런의 손실에 의해 특징 만성 진보적인 질병 이며 대뇌 피 질1,2,3,,45synapses. 광고의 고전 neuropathological 특징 녹말 체 펩 티 드의 증 착 이며 형성 된 neurofibrillary tangles (NFTs)6. 치 패, 녹말 체 패로 알려진 뇌 실질5β 주름을 잡은 구조를 형성 하는 아 밀 로이드 β (Aβ) 펩 티 드 구성 됩니다. 광고 환자에서 Aβ42의 축적 질병의 진행에는 초기 하 고 중요 한 역할을 하고있다. 광고의 시 냅 스 기능 장애, 장애인된 소성 및 신경 손실7,8,,910이벤트를 트리거합니다.

Teleost zebrafish의 두뇌의 줄기 세포가 소성11,12,13,,1415, 의 규칙을 공부 하는 우수한 모델 역할 16,,1718,,1920 및 광고21,22,23 포함 하 여 중앙 신경 시스템 (CNS)에 다양 한 질병 ,24. 사용할 수 있는 실험 방법을19,20,25,26,,2728,29, 의 광대 한 배열을 때문 30 , 31이 학문은 유익 하 고 실현. Zebrafish는 CNS13,15,32,33,,3435,36,37, 보충 수 있습니다. 38, 일부 신경 손실19,39,40,41,,4243, 후에 활성화 하는 분자 프로그램을 사용 하 여 44. 따라서, zebrafish neurodegenerative 질병 모델 수립 척 추가 있는 두뇌에서 재생 능력 및 줄기 세포 생물학에 관한 주소 소설 질문을 도울 수 있다.

최근에, 우리는 합성 Aβ42 펩 티 드 (표 1)39를 주입 하 여 성인 zebrafish 뇌에 아 밀 로이드 독성 모델 개발. 이 주입 발생 neurodegeneration 고기 (예를 들어, 세포 죽음, microglial 활성화, 시 냅 스 변성 및 메모리 적자), 인간의 두뇌 병 리를 연상 시키는 그 zebrafish 도출을 위해 사용할 수 있습니다 나타내는 zebrafish 뇌에서 neurodegeneration, 펩 티 드 immunohistochemical stainings, 및 CNS 수 성인 zebrafish에 중생의 분자 메커니즘으로 검출 될 수 있다 Aβ4239식별. 이 프로토콜에서 사용 하는 cerebroventricular 주입 (CVMI) 방법27,39,,4546 제 브라 두뇌에 합성 녹말 체 펩 티 드의 주입 시연 모방 녹말 체 증 착 (그림 1). CVMI 주입 β 장 구조에 따라 집계 하 고 독성을 발휘 펩 티 드를 제공의 새로운 방법을 제공 합니다. 펩 티 드 전체 rostro 꼬리 축45를 따라 심 실 지역 대상으로 뇌에 걸쳐 균등 하 게 배포 됩니다. 또한이 메서드는 녹말 체 포함에 따라 성인 zebrafish 두뇌에 있는 NSPCs의 형태학 및 분자 응답을 분석 하기 위한 수 있습니다. 이러한 연구 결과 제공할 것입니다 우리에 게 통찰력 포유류에서 성공적인 뇌 수리에 대 한. 광고 같은 증상이 보충 손실 된 신경 세포의 기능 회복을 유도 후 성공적인 재생 응답의 필요한 분자 메커니즘을 이해 하 우리의 메서드를 사용할 수 있습니다.

Protocol

이 프로토콜은 EU 지침에 의해 제안 된 표준 절차 (2010/63) 및 생물학 및 의학 (EuFishBioMed)에서 칼 스루 Insitute의 기술 (KIT)에서 물고기 모델에 대 한 유럽 사회. 여기 후 설명 하는 모든 메서드 (Landesdirektion 드레스덴; 문서 번호 TVV-52/2015) 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 1. Aβ42 펩 티 드의 준비 종합 펩 티 드 (표 1 참조) 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-와 표준 9-fl…

Representative Results

HPLC는 합성된 펩 티 드를 정화 하는 데 사용 되었다 그리고 질량 분석 순화 된 아 밀 로이드 β 펩 티 드를 특성화 하는 데 사용 되었습니다. HPLC 열 Aβ 펩 티 드의 분리를 개선 하는 50 ° C에가 열 되었다 그리고 모든 분수 수집 했다. 올바르게 합성된 펩 티 드를 식별 하기 위해 모든 분수에 대 한 질량 분광학 분석 수행 되었다. UPLC 크로마 화합물의 순도 보여준다. UPLC (즉</…

Discussion

녹말 체 펩 티 드 순서 변화 또는 다양 한 태그를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 스크램블된 녹말 체 펩 티 드 생성 될 수 있습니다, 그리고는 펩 티 드 펩 티 드 끝의 N-말단에 형광 태그와 함께 표시 하거나 캐리어 펩 티 드39태그 수 있습니다. 마찬가지로,이 프로토콜에 캐리어 펩타이드는 세포 관통 펩 티 드 TR 전송 화물 깊은 그 효과 때문에 뇌 조직39<…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 DZNE와 헬름홀츠 협회 (VH-NG-1021), CRTD에 의해 지원 되었다 TU 드레스덴 (FZ-111, 043_261518), 그리고 DFG (KI1524/6) (C.K.); 그리고에 의해 Leibniz 협회 (보고-2011-IPF-2) BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). 우리는 또한 감사 하 Ulrike 호프만 펩 티 드 종합을 위한 Nandini Asokan, Prayag Murawala, 그리고 엘리 다나카 절차를 촬영 하는 동안 도움 싶습니다.

Materials

Fmoc-protected amino acids IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1030 Activator
Oxyma IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1180 Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-003 Base
Dimethylformamide IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-004 Solvent
N-Methylmorpholine Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany A12158 Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) 157260 ALDRICH Activator
Piperidine MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 822299 Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 106050 Solvent
Formic acid (FA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 100264 Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 808260 Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 233781 ALDRICH Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH 34967-1L Solvent
Acetonitrile (for HPLC) VWR International Ltd, England 83639.320 Solvent
Diethylether VWR International Ltd, England 23811.326 Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT) VWR International Ltd, England 0281-25G Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) S30023 Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters Intavis AG (Cologne, Germany) 34.274 Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 11806-50-N Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe KC78.1 Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer Intavis, Cologne, Germany ResPep SL Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC Waters, Milford Massachusetts, USA Waters 2998, Waters e2695 Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm Phenomenex Ltd. Germany 00G-4328-N0 Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA LCPAK0001 Water purification system
Filtration Unit Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 16307 Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector Waters, Milford Massachusetts, USA M09UPA 664M Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm Waters, Milford Massachusetts, USA 186002350 Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector Waters, Milford Massachusetts, USA QBB908 Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany 16706, 101542 Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040
Petri dishes Sarstedt 821.472
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056
Needle Becton-Dickinson 305178
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10
PicoNozzle World Precision Instruments 5430-12
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG
Cryostat Leica CM1950
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Riferimenti

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Keywords: Amyloid-β42Alzheimer’s DiseaseAdult Zebrafish BrainNeural Stem CellsNeurodegenerationPeptide SynthesisFMOCHBTUDMFNMMCleavageHPLC
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Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).
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