Modelleren van Amyloid-β42 toxiciteit en neurodegeneratie in volwassen Zebrafish hersenen
Summary
Dit protocol beschrijft de synthese, karakterisering en injectie van monomeer amyloid-β42 peptiden voor het genereren van amyloïde toxiciteit in volwassen zebrafish om een model van de ziekte van Alzheimer, gevolgd door histologische analyses en detectie van samenvoegingen.
Abstract
De ziekte van Alzheimer (AD) is een slopende neurodegeneratieve ziekte in welke accumulatie van giftige amyloid-β42 (Aβ42) peptiden leidt tot synaptic degeneratie, ontsteking, neuronale dood, en leren van tekorten. Mensen kunnen niet verloren neuronen in het geval van AD ten dele als gevolg van verminderde proliferatieve capaciteit van de neurale stamcellen/voorlopercellen (NSPCs) en de verlaagde neurogenese regenereren. Daarom, efficiënte regeneratieve therapie moeten ook het versterken van de proliferatie neurogene capaciteit van NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is een regeneratieve organisme, en we kunnen leren van de fundamentele moleculaire programma’s waarmee we kunnen ontwerpen therapeutische benaderingen aan te pakken van AD. Om deze reden was de generatie van een AD-achtig model in zebrafish noodzakelijk. Met behulp van onze methodologie, kunnen we introduceren synthetische derivaten van Aβ42 peptide met weefsel indringend vermogen in het brein van volwassen zebrafish, en analyseren van de pathologie van de ziekte en de regeneratieve reactie. Het voordeel ten opzichte van de bestaande methoden of dierlijke modellen is dat zebrafish kan ons leren hoe een gewervelde brein kan natuurlijk regenereren, en dus helpen ons voor de behandeling van menselijke neurodegeneratieve ziekten beter richten op endogene NSPCs. Dus, het model van de amyloid-toxiciteit vastgesteld in de hersenen van volwassen zebrafish kan openen nieuwe mogelijkheden voor onderzoek op het gebied van de neurowetenschappen en klinische geneeskunde Bovendien is de eenvoudige uitvoering van deze methode zorgt voor kosteneffectieve en efficiënte experimentele evaluatie. Dit manuscript beschrijft de synthese en de injectie van Aβ42 peptiden in zebrafish hersenen.
Introduction
AD is een chronische progressieve ziekte die wordt gekenmerkt door het verlies aan neuronen en synapses in de hersenschors1,2,3,4,5. De klassieke neuropathologische kenmerken van AD zijn de afzetting van amyloid peptiden en vorming van de neurofibrillary tangles (NFTs)6. Seniele plaques, ook bekend als amyloïde plaques, zijn samengesteld uit amyloid-β (Aβ) peptiden die vormen van β-geplooid structuren in de hersenen parenchym5. De ophoping van Aβ42 in AD patiënten heeft een vroege en kritische rol bij progressie van de ziekte. AD triggert een cascade van gebeurtenissen die leiden tot synaptic dysfunctie, verminderde plasticiteit en neuronale verlies7,8,9,10.
Het volwassen brein van teleost zebrafish dient als een uitstekend model voor het bestuderen van de regulering van de stamcel plasticiteit11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 en diverse ziekten in het centrale zenuwstelsel (CNS), met inbegrip van AD21,22,23 ,24. Als gevolg van een breed scala van beschikbare experimentele methoden19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, deze studies zijn informatief en haalbaar. Zebrafish kan het aanvullen van de CNS13,15,32,33,34,35,,36,,37, 38, gedeeltelijk met behulp van moleculaire programma’s geactiveerd na neuronale verlies19,39,40,41,42,43, 44. Daarom, tot oprichting van een neurodegeneratieve ziekte model in zebrafish kan helpen nieuwe kwesties met betrekking tot de regeneratieve vermogen en stamcel biologie in gewervelde hersenen.
Onlangs, ontwikkelde we een model van de amyloïde toxiciteit in volwassen zebrafish hersenen door het injecteren van synthetische Aβ42 peptiden (tabel 1)39. Deze financiële injectie veroorzaakt neurodegeneratie fenotypen denken aan menselijk brein pathologie (b.v., celdood, microglial activering, synaptic degeneratie en geheugen tekorten), die aangeeft dat zebrafish kan worden gebruikt voor het opwekken neurodegeneratie in zebrafish hersenen, Aβ42 peptiden kunnen worden opgespoord met immunohistochemische technieken, en moleculaire mechanismen van regeneratie in volwassen zebrafish die CNS kan worden geïdentificeerd39. In dit protocol tonen we de injectie van synthetische amyloïde peptiden in de hersenen van de zebravis met behulp van een cerebroventricular injectie (CVMI) methode27,39,45,46 om na te bootsen amyloïde afzetting (Figuur 1). CVMI biedt een nieuwe manier van het leveren van de peptiden, die statistische na injectie als β-sheet structuren en uitoefenen toxiciteit. De peptiden zijn gelijkmatig verspreid in de hersenen, gericht op de ventriculaire gebied langs de gehele rostro-caudal as45. Bovendien kunt deze methode voor het analyseren van de morfologische en moleculair reactie van de NSPCs in volwassen zebrafish hersenen na amyloïde insluitsels. Dergelijk onderzoek levert ons een inzicht voor succesvolle hersenen reparatie bij zoogdieren. Onze methode kan worden gebruikt om te begrijpen van de nodige moleculair mechanisme van de reactie van een succesvolle regeneratie na AD-achtige symptomen voor het opwekken van aanvulling van verloren neuronen en functionele herstel.
Protocol
Representative Results
Discussion
De amyloïde peptiden kunnen worden gewijzigd zodat reeks variaties of verschillende labels. Bijvoorbeeld, een gecodeerde amyloïde peptide kan worden gegenereerd, en de peptiden kunnen worden gelabeld met de fluorescerende labels op de N-terminus van de peptide-einde of gelabeld met vervoerder peptiden39. Ook in dit protocol is de peptide vervoerder de cel-penetrating peptide TR vanwege de doeltreffendheid ervan naar vervoer cargo diep in de hersenen weefsel39. Daarnaast z…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door DZNE en de Helmholtz Association (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518), en DFG (KI1524/6) (CK); en door het Leibniz Association (SAW-2011-IPF-2) en goedgekeurd (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Wij ook bedank Ulrike Hofmann voor peptide synthese en Nandini Asokan, Prayag Murawala en Elly Tanaka voor hulp tijdens het filmen van de procedure.
Materials
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
Riferimenti
- LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Selkoe, D. J. Alzheimer’s disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Serpell, L. C. Alzheimer’s amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
- Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer’s disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer’s disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer’s disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
- McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer’s disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
- Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer’s disease?. Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
- Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer’s disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
- Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
- Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
- Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
- Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
- Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
- Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
- Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
- Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
- Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Katz, S., et al. . Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
- Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Sewald, N., Jakubke, H. . Peptides: Chemistry and Biology. , (2009).
- Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chimica. 22 (25), 8685-8693 (2016).
- Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
- Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
- Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
- Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).
