تقييم خصائص مضادة للالتهابات والتخثر غشائي الخلايا باستخدام الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد والدم كله غير أنتيكواجولاتيد
Summary
ونقدم في المختبر نموذجي الذي يسمح بدراسة وتحليل تخثر الدم في كامل، غير أنتيكواجولاتيد الدم. منع تخثر الدم في النظام يعتمد على تأثير التخثر الطبيعية من خلايا غشائي سليمة وسيؤدي إلى تنشيط الخلايا البطانية في تخثر الدم.
Abstract
في فيفو، خلايا بطانية لها أهمية حاسمة منع تخثر الدم الطبيعية المتمثلة في تعميم الدم. ونتيجة لذلك، تنشيط الخلية البطانية يؤدي إلى تخثر الدم. يتم ملاحظة هذه الظاهرة في كثير من الحالات السريرية، مثل زرع الأعضاء حضور قبل تشكيل الأجسام المضادة المضادة الجهات المانحة، بما في ذلك السلالة، فضلا عن إصابة الاسكيمية/ضخه. من أجل الحد من التجارب الحيوانية وفقا 3R المعايير (الحد والاستبدال والصقل)، في المختبر نماذج لدراسة تأثير الخلية غشائي التنشيط في تخثر الدم سيكون مرغوباً فيه جداً. ومع ذلك، توفر أنظمة المسطحة المشتركة الثقافة غشائي خلية نسبة السطح إلى الحجم من 1-5 سم2 من البطانة كل مل دم، والذي لا يكفي لمنع تخثر الدم الطبيعية، بطانية بوساطة. استزراع خلايا بطانية على الخرز ميكروكارير قد تزيد نسبة السطح إلى الحجم إلى 40-160 سم2/mL. هذا زيادة نسبة غير كافية لضمان منع تخثر الدم “الطبيعية” للدم كله، حتى أنه يمكن تجنب استخدام مضادات التخثر. هنا وصف لدراسة آثار التعديل الوراثي لخلايا بطانية الخنزير على تخثر الدم البشري غير أنتيكواجولاتيد كله، في المختبر ميكروكارير نظام قائم. في مقايسة الموصوفة، خلايا بطانية الابهر الأساسي الخنزير، أما نوع البرية (WT) أو المحورة وراثيا للبشرية CD46 ثرومبومودولين، نمت على حبات ميكروكارير وثم يتعرض للدم البشري الطازج مرسومة من غير أنتيكواجولاتيد. هذا النموذج يسمح للقياس والتقدير الكمي للإفراج عن سيتوكين فضلا عن تفعيل علامات لتكملة وتخثر في بلازما الدم. وباﻹضافة إلى ذلك، التصوير لتنشيط الخلية البطانية وترسب المناعية، مكملاً وتخثر البروتينات على الخرز اندوثيلياليزيد أجريت بالفحص المجهري [كنفوكل]. يمكن أيضا استخدام هذا التحليل لاختبار العقاقير التي من المفترض أن تمنع تنشيط الخلية البطانية، ومن ثم، تخثر الدم. علاوة على قدرتها على خفض عدد الحيوانات المستخدمة لمثل هذه التحقيقات، مقايسة وصف سهلة لتنفيذ واستمرار استنساخه.
Introduction
البطانة الوعائية تتكون من أحادي الطبقة لخلايا بطانية (EC) الذي خط التجويف الأوعية الدموية. في حالة فيزيولوجية، هادئة الجماعة الأوروبية المسؤولة عن الحفاظ على بيئة مضادة للالتهابات وتخثر الدم. 1 هذا هو وساطة من التعبير عن تخثر الدم والبروتينات المضادة للالتهابات على سطح المفوضية الأوروبية. على سبيل المثال، تنشيط الجماعة الأوروبية الناجمة عن الاسكيمية/ضخه الإصابة أو رفض الأوعية الدموية (كرة-) زرع أجهزة النتائج في تغيير سطح غشائي من تخثر الدم والدولة للالتهابات إلى تخثر المؤيدة والمحترفين التحريضية الدولة. 1
لدراسة التفاعل بين العوامل البطانة وتخثر، نماذج في المختبر التي تحاكي كرائعة ومعقدة عن كثب قدر الإمكان الحالة في فيفو مرغوب فيه للغاية. حد مشترك الذي يميز التقليدية في المختبر فحوصات تخثر الدم هو استخدام الدم أنتيكواجولاتيد مما يجعل تحليل الآثار بوساطة تخثر شاقة ولا يمكن استنساخها حتى ريكالسيفيكيشن من سيتراتيد الدم كله النتائج التي يمكن الحصول عليها بدماء جديدة غير أنتيكواجولاتيد. 2 وعلاوة على ذلك، في نظم الثقافة التقليدية مسطحة الخلية من المستحيل استغلال خصائص التخثر البطانة كما لا يمكن الوصول إلى سطح خلية بطانية كافية لحجم الدم. النموذج المعروض هنا ويتغلب على هذه القيود باستزراع المفوضية الأوروبية على سطح حبات كروية ميكروكارير، حيث أن نسبة سطح إلى دم المفوضية الأوروبية من > يمكن الوصول إلى/mL 16 سم2، وهي مماثلة للحالة في الشرايين الصغيرة أو الأوردة، و التي وصفت كافية للسماح لمنع تخثر الدم “الطبيعية” الدم بالسطح المفوضية الأوروبية. 3 , 4 يمكن استخدام الدم كله دون إضافة مضادات التخثر في هذا الإعداد. ويمكن جمع عينات الدم أثناء التجربة والسيتوكينات، وعوامل التخثر ويمكن الكشف عن علامات التنشيط مكملاً للذوبان وتقديرها كمياً. وعلاوة على ذلك، قد حلل الخرز ميكروكارير المغلفة بالمفوضية الأوروبية لترسب مكملاً والغلوبولين المناعي، فضلا عن التعبير عن علامات تنشيط الجماعة الأوروبية بالفحص المجهري [كنفوكل]. ويشمل تطبيق آخر للاهتمام اختبار العقاقير التي من المفترض أن تمنع تنشيط الخلية البطانية، ومن ثم، تخثر الدم. 5 على الرغم من أن هذا النموذج لا يمكن أن تحل تماما محل التجريب الحيواني، ويوفر طريقة لاختبار فرضيات وظيفية محددة السابقين فيفو استخدام الخلايا وبالتالي تقليل عدد الحيوانات المستخدمة في البحوث الأساسية بشأن الاسكيمية/الاكسجينيه زرع الإصابة أو (كرة).
استخدم نموذج وصف لتقليد السلالة من الإعداد في أي خلايا بطانية الابهري الخنزير (الباكستانية) هي نمت على الخرز ميكروكارير والمحتضنة مع الدم البشري غير أنتيكواجولاتيد كله،. وجرى تحليل الباكستانية المعدلة وراثيا مختلفة، تحمل جينات بشرية عديدة مثل CD46 لتنظيم نظام مكمل و/أو ثرومبومودولين (هتبم) لتنظيم نظام تخثر الدم، لخصائصها التخثر. محكم الخاضعة لسيطرة نظم غشائي خلية التنشيط وتكملة والتخثر ومترابطة. 6 فمن المهم أن نفهم كيف تتصرف الخلايا المحورة وراثيا مختلفة بعد التعرض للدم البشري فيما يتعلق بالتصاق جزيء التعبير والإفراج عن سيتوكين، ذرف جليكوكاليكس وفقدان البروتينات التخثر. 7
Protocol
Representative Results
Discussion
النموذج المعروض هنا مناسبة تجلط الدم المتصلة بالدراسات يسمح تحليل جوانب مختلفة من التخثر وتفاعله مع الجماعة الأوروبية. 8 في البحوث السلالة، ونظام مفيد لاختبار التخثر خصائص مختلفة ECs الخنزير المعدلة وراثيا بعد الحضانة مع الدم البشري 9.
الخطوات الأك…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة “مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية” (سنسف، رقم المنحة 320030_156193). يشكر المؤلفون الدكتور بونوا ويرلين لتوفير الخرز ميكروكارير بيوسيلون. ونشكر أيضا الأستاذ الدكتور هانز بيتر كولر والبروفسور أندريه هايبيرلي للمساعدة في إعداد نموذج حبة ميكروكارير.
Materials
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit – FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Needle | Becton Dickinson | 367286 | Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4") |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2mL in 500mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
Riferimenti
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
- Rajwal, S., Richards, M., O’Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood – a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
- Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
- Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
- Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
- Cowan, P. J., d’Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
- Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
- Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
- Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
- Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
