Оценка антикоагулянт и противовоспалительных свойств эндотелиальных клеток с использованием 3D клеточной культуры и не антикоагулянтом цельной крови
Summary
Мы представляем в vitro модель, которая позволяет изучение и анализ свертывающей системы в целом, не антикоагулянтом крови. Антикоагуляционную в системе зависит от природных Антисвертывающая эффект здоровых эндотелиальных клеток и активации эндотелиальных клеток приведет к свертывания.
Abstract
В естественных условиях, эндотелиальные клетки имеют решающее значение для естественной антикоагуляционную циркулирующей крови. Следовательно активацию эндотелиальных клеток приводит к коагуляции крови. Это явление наблюдается во многих клинических ситуациях, как трансплантация присутствии предварительно сформированных антитела анти доноров, включая ксенотрансплантации, а также в ишемии/реперфузии травмы. Для того, чтобы уменьшить экспериментов на животных согласно 3R стандартов (сокращение, замена и уточнение), в пробирке модели для изучения влияния эндотелиальных клеток весьма желательно активации на свертываемость крови. Однако общие бортовой системы эндотелиальных клеток культуры обеспечивают отношение поверхности к объему 1-5 см2 эндотелия на мл крови, который не является достаточным для естественных, эндотелия опосредованной антикоагуляционную. Культивирование эндотелиальных клеток на microcarrier бисер может увеличить отношение поверхности кобъему/2мл 40-160 см. Это увеличение соотношения достаточно для обеспечения «естественных» антикоагуляционную цельной крови, так что можно избежать использование антикоагулянтов. Здесь описан в пробирке microcarrier систему на основе для изучения последствий генетической модификации свинину эндотелиальных клеток на свертываемость крови человека целиком, не антикоагулянтом. В описанных assay, первичный свинину аорты эндотелиальных клеток, либо дикого типа (WT) или трансгенных человеческих CD46 и Тромбомодулин, были выросли на microcarrier бусы и затем подвергается свежезаваренным нарисованные не антикоагулянтом человеческой крови. Эта модель позволяет измерение и количественное определение цитокинов выпуска, а также активации маркеры дополняют и коагуляции в плазме крови. Кроме того визуализация активированного эндотелиальных клеток и отложения иммуноглобулинов, дополнением и коагуляции белков на эндотелизированных бусины были исполнены confocal микроскопии. Этот assay может также использоваться для проверки наркотиков, которые должны предотвратить активацию эндотелиальных клеток и, таким образом, коагуляции. На вершине ее потенциал, чтобы уменьшить количество животных, используемых для таких расследований описанных assay легко выполнять и последовательно воспроизводимость.
Introduction
Эндотелия состоит из монослоя эндотелиальных клеток (ЕС), которые линия просвета кровеносных сосудов. В состоянии физиологического покоя EC отвечает за поддержание антикоагулянт и противовоспалительными среды. 1 это опосредовано выражением антикоагулянт и противовоспалительными белков на поверхности ЕС. Например, ЕС активации, вызванные ишемии/реперфузии травмы или сосудистая неприятие (xeno-) пересадки органов результаты изменения эндотелиальных поверхности от антикоагулянт и противовоспалительными состояние про коагулянта и про воспалительных состояние. 1
Для изучения увлекательный и сложные взаимодействия между эндотелия и коагуляции факторы, в пробирке модели, которые имитируют как максимально близко в естественных условиях ситуация весьма желательно. Общие ограничения, которое характеризует обычные в vitro коагуляции анализов является использование антикоагулянтом крови, что делает анализ коагуляции опосредованной эффекты напряженных и даже recalcification citrated цельной крови невозможно воспроизвести результаты получить свежие номера антикоагулянтом кровью. 2 Кроме того, в системах культуры традиционных безбортовой ячейки невозможно эксплуатировать антикоагулянт свойства эндотелия, как не может быть достигнуто достаточно эндотелиальных клеток поверхности на единицу объема крови. Модель, представленная здесь преодолевает эти ограничения, культивирование ЕС на поверхности сферического microcarrier бусы, так что отношение поверхности к крови EC > 16 см2/мл может быть достигнуто, которая похожа на ситуацию в небольших артериол или Вены, и который был описан быть достаточным, чтобы позволить «естественных» антикоагуляционную крови поверхности ЕС. 3 , 4 цельной крови может использоваться без добавлена антикоагулянтов в этот параметр. Образцы крови могут быть собраны в ходе эксперимента и цитокины, факторы свертывания крови и растворимых дополнение активации маркеры могут быть обнаружены и количественно. Кроме того EC-покрытием microcarrier бусы могут быть проанализированы для дополнения и иммуноглобулина осаждения, а также выражение маркеров активации EC confocal микроскопии. Другое интересное приложение включает в себя тестирование препаратов, которые должны предотвратить активацию эндотелиальных клеток и, таким образом, коагуляции. 5 хотя эта модель не может полностью заменить экспериментов на животных, он предоставляет метод для проверки конкретных функциональных гипотезы ex vivo с использованием клеток и таким образом уменьшить количество животных, используемых в фундаментальных исследований по ишемии/реперфузии травмы или (xeno) трансплантации.
Описывается модель использовалась для имитации ксенотрансплантации, в котором свинину аорты эндотелиальных клеток (паек) вырос на microcarrier бусы и инкубировали с весь, не антикоагулянтом человеческой крови. Различные трансгенных паек, перевозящих несколько генов человека как CD46 для регулирования системы комплемента и/или Тромбомодулин (hTBM) для регулирования системы коагуляции, были проанализированы на предмет их антикоагулянт свойств. Эндотелиальные клетки активации, дополнением и коагуляции системы плотно контролируются и взаимосвязаны. 6 поэтому важно понять, как различные трансгенных клетки ведут себя после воздействия на кровь человека выражение молекулы адгезии и релиз цитокинов, пролития Гликокаликс и потери антикоагулянт белков. 7
Protocol
Representative Results
Discussion
Модель, представленная здесь подходит для коагуляции соответствующих исследований, позволяя анализ различных аспектов коагуляции и его взаимодействие с ЕС. 8 в ксенотрансплантации исследований, это удобная система для тестирования антикоагулянт свойства различных гене?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Швейцарский Национальный научный фонд (SNSF, Грант № 320030_156193). Авторы благодарят доктор Бенуа Werlen за предоставление бусы microcarrier Biosilon. Мы также благодарим профессор Ганс Петер Колер и профессор Андре Haeberli за помощь в настройке модели бисера microcarrier.
Materials
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit – FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Needle | Becton Dickinson | 367286 | Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4") |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2mL in 500mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
Riferimenti
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
- Rajwal, S., Richards, M., O’Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood – a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
- Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
- Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
- Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
- Cowan, P. J., d’Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
- Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
- Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
- Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
- Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
