Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi
Summary
Biz bütün, anticoagulated kan çalışma ve koagülasyon analizini sağlayan bir vitro modeli mevcut. Anticoagulation sistemi sağlıklı endotel hücreleri doğal anticoagulation etkisi bağlıdır ve endotel hücre aktivasyonu pıhtılaşma içinde sonuçlanır.
Abstract
Vivo, endotel hücreleri kan dolaşan doğal anticoagulation için büyük önem taşımaktadır. Sonuç olarak, endotel hücre aktivasyonu kan pıhtılaşması için yol açar. Bu olay xenotransplantation, dahil olmak üzere önceden biçimlendirilmiş Anti-donör antikorların varlığında organ nakli gibi birçok klinik durumlarda yanı sıra iskemi/reperfüzyon hasarı görülmektedir. Endotel hücre etkisini incelemeye 3R standartları (azaltma, değişim ve arıtma), vitro modellerine göre hayvan deney azaltmak için harekete geçirmek üstünde kan pıhtılaşması son derece cazip olurdu. Ancak, endotel hücre kültürünün ortak Kafesli döşeme sistemleri 1-5 cm2 . endotel mL doğal, endotel aracılı anticoagulation için yeterli değil kan başına bir yüzey hacim oranı sağlar. Microcarrier boncuk endotel hücre kültürü çalışmalarının 40-160 cm2/mL için yüzey hacim oranı artabilir. Böylece antikoagülan kullanımı önlenebilir artan bu oran tam kan, “doğal” anticoagulation emin olmak yeterlidir. Burada vitro microcarrier tabanlı bir sistemin tüm, Sigara anticoagulated insan kan pıhtılaşması domuz endotel hücrelerinin genetik değişikliği etkilerini incelemek için tanımlanır. Açıklanan tahlil, birincil domuz aort endotel hücreleri, vahşi türlerinden (WT) veya transgenik insan CD46 ve thrombomodulin, microcarrier boncuk üzerinde yetiştirilen ve taze çekilmiş sigara anticoagulated insan kanı için maruz. Bu modeli ölçüm ve miktar sitokin yayın hem de harekete geçirmek için tamamlayıcı ve kan plazma koagülasyon işaretleri verir. Buna ek olarak, düşsel aktive endotel hücre ve immünglobulin birikimi, tamamlayıcı ve pıhtılaşma proteinleri endothelialized boncuk üzerinde confocal mikroskobu tarafından gerçekleştirilmiştir. Bu tahlil de endotel hücre aktivasyonu ve böylece, koagulasyon önlemek için gereken ilaçlar test etmek için kullanılabilir. Bu tür araştırmalar için kullanılan hayvan sayısını azaltmak için potansiyel üzerine, açıklanan tahlil gerçekleştirmek kolay ve tutarlı bir şekilde tekrarlanabilir.
Introduction
Vasküler endotel kan damarlarının Lümen satır endotel hücreleri (EC) monolayer oluşur. Fizyolojik bir durumda deneniyor EC bir antikoagülan ve anti-inflamatuar çevre bakımı için sorumludur. 1 bu ifade antikoagülan ve EC yüzeyinde anti-inflamatuar proteinler tarafından aracılık ettiği. Örneğin, EC harekete geçirmek iskemi/reperfüzyon tarafından kaynaklanan yaralanma veya vasküler reddedilmesi (xeno-) nakledilen bir değişiklik endotel yüzeyinden bir antikoagülan ve anti-inflamatuar devlet yanlısı koagulant ve pro-inflamatuar sonuçlarında organları Devlet. 1
Endotel ve koagülasyon faktörleri, olarak taklit vitro modelleri arasında büyüleyici ve karmaşık etkileşim çalışmaya mümkün olduğunca vivo içinde durum son derece cazip. Geleneksel vitro koagülasyon testleri karakterize yaygın bir sınırlama koagülasyon-aracılı etkileri analiz zorlu kılan anticoagulated kan kullanılır ve citrated tam kan bile recalcification yeniden olamaz sonuçları taze sigara anticoagulated kan ile elde edilebilecek. 2 Ayrıca, geleneksel Düz Yataklı hücre kültürü sistemlerinde bu yeterli bir endotel hücre yüzey kan birim başına ulaştı olarak endotel antikoagülan özelliklerini yararlanmak mümkün değildir. Burada sunulan model EC küresel microcarrier boncuk, yüzeyde kültür tarafından bu sınırlamalar üstesinden gelir böylece bir EC yüzey kan oranı > 16 cm2/mL ulaşılabilir, hangi küçük arteriyoller ya da damarlar, durumda benzer ve hangi kan “doğal” anticoagulation izin vermek yeterli olmak EC yüzey tarafından tanımlanmıştır. 3 , 4 tam kan olmadan eklenen antikoagülanlar bu ortamda kullanılabilir. Kan örnekleri toplanan deney ve sitokinler, koagülasyon faktörleri sırasında ve çözünür tamamlayıcı aktivasyon belirteçleri algılanır ve sayılabilir. Ayrıca, EC kaplı microcarrier boncuk ifade EC harekete geçirmek işaretleri yanı sıra tamamlayıcı ve immünglobulin ifade tarafından confocal mikroskobu analiz. Başka bir ilginç uygulama endotel hücre aktivasyonu ve böylece, koagulasyon önlemek gerekiyordu uyuşturucu testi içerir. 5 her ne kadar bu model tamamen hayvan deney yerini alamaz, belirli fonksiyonel hipotezler ex vivo hücre kullanarak test etmek ve böylece iskemi/reperfüzyon üzerinde temel araştırmalarda kullanılan hayvan sayısını azaltmak için bir yöntem sunar yaralanma ya da (xeno) nakli.
Açıklanan modeli domuz aort endotel hücreleri (PAEC) microcarrier boncuk büyüdü ve tüm, anticoagulated insan kanı ile inkübe ayarlama bir xenotransplantation taklit etmek için kullanıldı. Kompleman sistemi ve/veya thrombomodulin (hTBM) düzenleme koagülasyon sisteminin düzenlenmesi için CD46 gibi birçok insan genleri taşıyan farklı transgenik PAEC onların antikoagülan özelliklerini analiz. Endotel hücre harekete geçirmek, tamamlayıcı ve koagülasyon sistemleri sıkı kontrol ve birbirine bağlı. 6 bu nedenle nasıl adezyon molekül ifade ve sitokin yayın, insan kanı maruz kaldıktan sonra farklı transgenik hücreleri davrandığını anlamak önemlidir glycocalyx ve antikoagülan protein kaybı dökülme. 7
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan model koagülasyon için uygundur ile ilgili çalışmalar koagülasyon ve EC ile etkileşimi farklı yönlerini analiz izin 8 xenotransplantation araştırma, insan kanı 9kuluçka sonra farklı genetik olarak değiştirilmiş domuz ECs antikoagülan özelliklerini sınamak için kullanışlı bir sistem olduğunu.
Bu deney başlamadan önce tam hücre kapsama (confluency) lastikteki sağlanması ve bu dikkatli koleksiyonuna ait v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından (SNSF, Grant No. 320030_156193) destek verdi. Yazarlar Dr Benoît Werlen Biosilon microcarrier boncuk verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz Ayrıca Prof. Hans Peter Kohler ve Prof. André Haeberli microcarrier boncuk modelini oluşturan ayarlama konusunda yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit – FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Needle | Becton Dickinson | 367286 | Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4") |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2mL in 500mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
Riferimenti
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
- Rajwal, S., Richards, M., O’Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood – a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
- Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
- Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
- Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
- Cowan, P. J., d’Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
- Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
- Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
- Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
- Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
