Evaluación de las propiedades anticoagulantes y antiinflamatorias de las células endoteliales mediante cultivo celular 3D y sangre no anticoagulada
Summary
Se presenta un modelo en vitro que permite el estudio y análisis de la coagulación en sangre no anticoagulada todo. Anticoagulación en el sistema depende el efecto de anticoagulación natural de las células endoteliales sanas y activación de células endoteliales resultará en la coagulación.
Abstract
In vivo, las células endoteliales son cruciales para la anticoagulación natural de sangre circulante. En consecuencia, activación de la célula endotelial conduce a la coagulación de la sangre. Este fenómeno se observa en muchas situaciones clínicas, como el trasplante de órganos en presencia de formados anticuerpos de anti-donantes, como xenotrasplante, así como en la isquemia/reperfusión. Con el fin de reducir la experimentación animal según el 3R estándares (reducción, reemplazo y refinamiento), en vitro modelos para estudiar el efecto de la célula endotelial, activación de la coagulación de la sangre sería muy deseable. Sin embargo, sistemas comunes de plano de la cultura de célula endotelial ofrecen una relación superficie a volumen de 1-5 cm2 de endotelio por mL de sangre, que no es suficiente para la anticoagulación natural, mediada por el endotelio. Cultivo de células endoteliales en la cuenta de la potencia puede aumentar la relación superficie-volumen 40-160 cm2/ml. Este ratio mayor es suficiente para asegurar la anticoagulación “natural” de sangre, por lo que puede evitarse el uso de anticoagulantes. Aquí se describe para estudiar los efectos de la modificación genética de las células endoteliales porcinas en coagulación de la sangre no anticoagulada todo, un en vitro potencia-sistema basado. En el análisis descrito, células endothelial aórticas porcinas primarias, ya sea tipo salvaje (WT) o transgénicos para humanos CD46 y trombomodulina, crecido en granos de potencia y luego expuesto a sangre humana recién extraída sin anticoagulante. Este modelo permite la medición y cuantificación de la liberación de citoquinas y activación marcadores de complemento y coagulación en el plasma sanguíneo. Además, la proyección de imagen de células endoteliales activadas y la deposición de inmunoglobulinas, complemento y coagulación de proteínas en los granos endotelizados fueron realizadas por microscopia confocal. Este ensayo también puede utilizarse para probar fármacos que se suponen para evitar la coagulación y, por tanto, la activación endotelial de la célula. Encima de su potencial para reducir el número de animales utilizados para tales investigaciones, el ensayo descrito es fácil de realizar y consistentemente reproducible.
Introduction
El endotelio vascular consiste en una monocapa de células endoteliales (CE) que recubren el lumen de los vasos sanguíneos. En un estado fisiológico, CE quieto son responsables por el mantenimiento de un entorno antiinflamatorio y anticoagulante. 1 esto es mediado por la expresión de anticoagulantes y antiinflamatorias proteínas en la superficie de la CE. Por ejemplo, activación de CE causada por isquemia/reperfusión lesiones o rechazo vascular (xeno-) trasplantados resultados de órganos en un cambio de la superficie endotelial de un anticoagulante y antiinflamatorio estado Pro coagulante y pro-inflamatoria Estado. 1
Para estudiar la fascinante y compleja interacción entre los factores del endotelio y coagulación, en vitro modelos que imitan como posible la situación en vivo son altamente deseables. Una limitación común que caracteriza a ensayos de coagulación convencional en vitro es el uso de sangre con anticoagulante que hace que el análisis de los efectos de la coagulación mediada por ardua y no se puede reproducir incluso recalcificación de la sangre entera citratado resultados obtenibles con sangre fresca sin anticoagulante. 2 además, en los sistemas de cultivo celular de plano tradicional es imposible explotar las propiedades anticoagulantes del endotelio como una suficiente superficie de la célula endotelial por el volumen de sangre no se puede llegar. El modelo presentado aquí supera estas limitaciones por CE el cultivo en la superficie de los granos de la potencia esférica, de modo que una proporción de superficie a sangre CE de > 16 cm2/ml puede ser alcanzado, que es similar a la situación en las pequeñas arteriolas o venas, y que fue descrito para ser suficiente para permitir la “natural” anticoagulación de la sangre por la superficie de la CE. 3 , 4 puede utilizarse sangre entera sin agregado anticoagulantes en este contexto. Muestras de sangre se pueden recoger durante el experimento y citoquinas, factores de coagulación y marcadores de la activación de complemento soluble pueden ser detectados y cuantificados. Además, granos recubiertos de CE potencia pueden analizarse para la deposición del complemento y de inmunoglobulinas así como la expresión de marcadores de activación de CE por microscopia confocal. Otra aplicación interesante incluye la prueba de drogas que se suponen para evitar la coagulación y, por tanto, la activación endotelial de la célula. 5 aunque este modelo no puede sustituir completamente los experimentos con animales, ofrece un método para probar hipótesis funcionales específicas ex vivo con células y reducir así el número de animales utilizados en investigación básica en isquemia/reperfusión trasplante de la lesión o (xeno).
El modelo descrito fue utilizado para imitar un xenotrasplante en que células endoteliales aórticas porcinas (PAEC) son cultivadas en los granos de potencia y se incubaron con todo, no anticoagulada sangre humana. Se analizaron diferentes PAEC transgénico, portadores de varios genes humanos como CD46 para la regulación del sistema del complemento o trombomodulina (hTBM) para la regulación del sistema de coagulación, por sus propiedades anticoagulantes. Sistemas de activación de complemento y coagulación de células endoteliales bien controlados y conectadas entre sí. 6 por lo tanto es importante entender cómo se comportan las células transgénicas diferentes tras la exposición a sangre humana con respecto a la expresión de la molécula de adhesión y liberación de citoquinas, vertimiento del glicocálix y pérdida de proteínas anticoagulantes. 7
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo presentado aquí es conveniente para la coagulación relacionados con estudios, que permite el análisis de diferentes aspectos de la coagulación y su interacción con EC. 8 en la investigación del xenotransplantation, es un sistema útil para probar las propiedades anticoagulantes de la ECs porcinos genéticamente diferentes después de la incubación con sangre humana 9.
Los pasos más críticos del protocolo son los asegurar cobert…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Fundación Suiza de ciencia nacional (FNS, Grant No. 320030_156193). Los autores agradecen a Dr. Benoît Werlen para proporcionar los granos de potencia Biosilon. También agradecemos el Prof. Hans Peter Kohler y Prof. André Haeberli ayuda para configurar el modelo de grano potencia.
Materials
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit – FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Needle | Becton Dickinson | 367286 | Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4") |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2mL in 500mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
Riferimenti
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