3 डी सेल संस्कृति और गैर anticoagulated पूरे रक्त का उपयोग कर Endothelial कोशिकाओं के थक्कारोधी और विरोधी भड़काऊ गुणों का आकलन
Summary
हम एक इन विट्रो मॉडल जो अध्ययन और पूरे, गैर anticoagulated रक्त में जमावट के विश्लेषण की अनुमति देता है पेश करते हैं । प्रणाली में एंटिकोगुलेशन स्वस्थ endothelial कोशिकाओं के प्राकृतिक एंटिकोगुलेशन प्रभाव पर निर्भर करता है और endothelial कोशिका सक्रियण के थक्के में परिणाम होगा ।
Abstract
vivo में, endothelial कोशिकाओं रक्त संचार के प्राकृतिक एंटिकोगुलेशन के लिए महत्वपूर्ण हैं । नतीजतन, endothelial सेल सक्रियण रक्त जमावट की ओर जाता है । यह घटना कई नैदानिक स्थितियों में मनाया जाता है, पूर्व की उपस्थिति में अंग प्रत्यारोपण की तरह-विरोधी दाता एंटीबॉडी xenotransplantation सहित, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ischemia में/reperfusion चोट । आदेश में 3R मानकों के अनुसार पशु प्रयोग को कम करने के लिए (कमी, प्रतिस्थापन और शोधन), इन विट्रो मॉडल रक्त जमावट पर endothelial कोशिका सक्रियण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक वांछनीय होगा. हालांकि, endothelial सेल संस्कृति के आम flatbed प्रणालियों के 1-5सेमी 2 रक्त की प्रति मिलीलीटर, जो प्राकृतिक, endothelial मध्यस्थता एंटिकोगुलेशन के लिए पर्याप्त नहीं है की एक सतह से मात्रा अनुपात प्रदान करते हैं । microcarrier मोतियों पर संवर्धन endothelial कोशिकाओं ४०-१६० cm2/mL. के लिए सतह से मात्रा अनुपात बढ़ सकता है यह बढ़ा हुआ अनुपात पूरे रक्त के ‘ प्राकृतिक ‘ एंटिकोगुलेशन को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है, ताकि थक्का के उपयोग से बचा जा सके. यहां एक इन विट्रो microcarrier-आधारित प्रणाली पूरी, गैर anticoagulated मानव रक्त के जमावट पर सुअर endothelial कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए वर्णन किया गया है । वर्णित परख में, प्राथमिक सुअर महाधमनी endothelial कोशिकाओं, या तो जंगली प्रकार (WT) या ट्रांसजेनिक मानव CD46 और thrombomodulin के लिए, microcarrier मोतियों पर बड़े हो रहे थे और फिर हौसले से तैयार गैर anticoagulated मानव रक्त से अवगत कराया । यह मॉडल माप और cytokine रिहाई के साथ ही पूरक और रक्त प्लाज्मा में जमावट के सक्रियण मार्कर के ठहराव के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, सक्रिय endothelial सेल और इम्युनोग्लोबुलिन के जमाव की इमेजिंग, पूरक और endothelialized मोतियों पर जमावट प्रोटीन फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदर्शन किया गया । इस परख भी दवाओं जो endothelial सेल सक्रियकरण को रोकने के लिए और, इस प्रकार, जमावट माना जाता है परीक्षण किया जा सकता है । अपनी क्षमता के शीर्ष पर इस तरह की जांच के लिए इस्तेमाल जानवरों की संख्या को कम करने के लिए, वर्णित परख प्रदर्शन करने के लिए और लगातार प्रतिलिपि आसान है ।
Introduction
संवहनी endothelium endothelial कोशिकाओं (ईसी) जो रक्त वाहिकाओं के लुमेन लाइन की एक monolayer के होते हैं । एक शारीरिक स्थिति में, quiescent चुनाव आयोग एक थक्कारोधी और विरोधी भड़काऊ वातावरण के रखरखाव के लिए जिंमेदार हैं । 1 यह चुनाव आयोग की सतह पर थक्कारोधी और विरोधी भड़काऊ प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा मध्यस्थता है । उदाहरण के लिए, चुनाव आयोग के ischemia/reperfusion चोट या संवहनी अस्वीकृति की वजह से (एक्सो-) प्रत्यारोपण अंगों एक थक्कारोधी और विरोधी भड़काऊ राज्य से एक समर्थक कौयगुलांट और समर्थक भड़काऊ करने के लिए endothelial सतह के परिवर्तन में परिणाम राज्य. 1
endothelium और जमावट कारकों के बीच आकर्षक और जटिल बातचीत का अध्ययन करने के लिए, इन विट्रो मॉडल जो के रूप में निकटता के रूप में संभव के रूप में नकल में vivo स्थिति अत्यधिक वांछनीय हैं । एक आम सीमा है जो इन विट्रो जमावट परख में पारंपरिक की विशेषता है anticoagulated रक्त जो जमावट की मध्यस्थता प्रभाव दुरूह और यहां तक कि recalcification पूरे रक्त की प्रतिलिपि नहीं बना सकते है के विश्लेषण बनाता है का उपयोग है ताजा गैर anticoagulated रक्त के साथ परिणाम प्राप्य । 2 इसके अलावा, पारंपरिक फ्लैट बिस्तर सेल संस्कृति प्रणालियों में यह endothelium के थक्कारोधी गुणों का दोहन करने के लिए असंभव है के रूप में रक्त की मात्रा प्रति पर्याप्त endothelial कोशिका सतह तक नहीं पहुंचा जा सकता है । यहां प्रस्तुत मॉडल गोलाकार microcarrier मोतियों की सतह पर संवर्धन चुनाव आयोग द्वारा इन सीमाओं पर काबू पा, इतना है कि एक चुनाव आयोग की सतह के लिए रक्त अनुपात & #62; 16 सेमी2/mL तक पहुंचा जा सकता है, जो छोटे धमनियों या नसों में स्थिति के समान है, और जिसमें ईसी सरफेस द्वारा खून की “नेचुरल” एंटिकोगुलेशन को अनुमति देने के लिए पर्याप्त बताया गया था । 3 , 4 पूरे रक्त का उपयोग इस सेटिंग में जोड़े गए थक्का के बिना किया जा सकता है । रक्त के नमूनों प्रयोग और साइटोकिंस के दौरान एकत्र किया जा सकता है, जमावट कारकों और घुलनशील पूरक सक्रियण मार्करों का पता लगाया जा सकता है और मात्रा. इसके अलावा, चुनाव आयोग लेपित microcarrier मोती पूरक के लिए विश्लेषण किया जा सकता है और immunoglobulin बयान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा चुनाव आयोग सक्रियकरण मार्करों की अभिव्यक्ति । एक और दिलचस्प आवेदन endothelial सेल सक्रियण को रोकने के लिए और, इस प्रकार, जमावट माना जाता है जो दवाओं के परीक्षण भी शामिल है । 5 हालांकि इस मॉडल को पूरी तरह से पशु प्रयोग की जगह नहीं कर सकते, यह एक विधि प्रदान करता है विशिष्ट कार्यात्मक परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए पूर्व vivo कोशिकाओं का उपयोग और इस प्रकार ischemia पर बुनियादी अनुसंधान में इस्तेमाल जानवरों की संख्या को कम/reperfusion चोट या (एक्सो) ट्रांसप्लांटेशन ।
वर्णित मॉडल एक xenotransplantation सेटिंग जिसमें सुअर महाधमनी endothelial कोशिकाओं (PAEC) microcarrier मोतियों पर बड़े हो रहे है और पूरे, गैर anticoagulated मानव रक्त के साथ मशीन की नकल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । विभिंन ट्रांसजेनिक PAEC, इस तरह के पूरक प्रणाली के विनियमन के लिए CD46 के रूप में कई मानव जीन ले जाने और/या जमावट प्रणाली के विनियमन के लिए thrombomodulin (hTBM), उनके थक्कारोधी गुणों के लिए विश्लेषण किया गया । Endothelial सेल सक्रियण, पूरक, और जमावट प्रणालियों कसकर नियंत्रित कर रहे हैं और परस्पर । 6 यह समझने के लिए कि कैसे अलग ट्रांसजेनिक कोशिकाओं आसंजन अणु अभिव्यक्ति और cytokine रिहाई के संबंध में मानव रक्त के संपर्क के बाद व्यवहार महत्वपूर्ण है, glycocalyx और थक्कारोधी प्रोटीन के नुकसान का छप्पर । 7
Protocol
जर्मन Landrace सूअर (जंगली प्रकार एक स्थानीय फार्महाउस में नस्ल और आणविक पशु प्रजनन और जैव प्रौद्योगिकी, लुडविग-मैक्सीमिलियन विश्वविद्यालय, म्यूनिख, जर्मनी) के संस्थान में नस्ल ट्रांसजेनिक, 30 किलो के बीच …
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत मॉडल जमावट से संबंधित अध्ययन और चुनाव आयोग के साथ अपनी बातचीत के विभिन्न पहलुओं के विश्लेषण की अनुमति देने के अध्ययनों के लिए उपयुक्त है । 8 xenotransplantation अनुसंधान में, यह मानव रक्त <sup class…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (SNSF, ग्रांट नो 320030_156193) ने समर्थन दिया था । लेखकों ने डॉ॰ Benoît Werlen को Biosilon microcarrier मोतियों की माला प्रदान करने के लिए धन्यवाद दिया । हम भी microcarrier मनका मॉडल की स्थापना के साथ मदद के लिए प्रो हंस पीटर कोल और प्रो आंद्रे Haeberli धंयवाद ।
Materials
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit – FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Needle | Becton Dickinson | 367286 | Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4") |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2mL in 500mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
Riferimenti
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