Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen
Summary
Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een in vitro menselijke preklinische model van osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten gekweekt met borst kanker cellijnen na te bootsen de kanker cel-osteoclast interactie. Het model kan worden gebruikt om verdere van ons begrip van metastase biomineralisatie en therapeutische opties te verbeteren.
Abstract
De Overspraak tussen tumorcellen en bot cellen in het bot-communicatie is van cruciaal belang voor het begrip van het mechanisme van metastase biomineralisatie. We een in vitro volledig menselijk preklinische model ontwikkeld van een co cultuur van borstkankercellen en monocyten ondergaan differentiatie naar osteoclasten. We een model van osteoclastogenesis vanaf een steekproef van perifeer bloed verkregen van gezonde donoren geoptimaliseerd. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) waren eerst gescheiden door dichtheid kleurovergang centrifugeren, ontpit op een hoge dichtheid en geïnduceerde te onderscheiden door de toevoeging van twee groeifactoren (GFs): receptor activator van nucleaire factor-recombination ligand (RANKL) en macrofaag kolonie-stimulerende factor (MCSF). De cellen waren nog in cultuur voor 14 dagen vast en geanalyseerd door downstream analyse. In osteolytic botmetastasen is een van de gevolgen van kanker cel aankomst in bot de inductie van osteoclastogenesis. We dus ons model met co culturen van borstkankercellen te bestuderen van de kracht van de differentiatie van de kankercellen met betrekking tot de GFs uitgedaagd. Een eenvoudige manier voor het bestuderen van kanker cel-osteoclast interactie is voor het uitvoeren van indirecte co culturen, gebaseerd op het gebruik van geconditioneerde medium verzameld uit borst kanker celculturen en gemengd met verse medium. Dit mengsel wordt vervolgens gebruikt voor het opwekken van osteoclast differentiatie. Wij ook geoptimaliseerd voor een methode van directe co cultuur in welke kanker cellen en monocyten differentiatie ondergaan delen van het medium en wisselen secreted factoren. Dit is een significante verbetering over de oorspronkelijke methode van de indirecte samenwerking cultuur als onderzoekers kunnen de wederzijdse interactie van de twee celtypes observeren en downstream-analyses voor zowel de kankercellen als de osteoclasten uitvoeren. Deze methode kan we bestuderen het effect van drugs op de communicatie van uitgezaaide bot en zaad cellijnen die niet worden afgeleid van borstkanker. Het model kan ook worden gebruikt om te bestuderen van andere ziekten zoals osteoporose of andere bot-voorwaarden.
Introduction
Bot is een gemeenschappelijke site van metastase voor verschillende soorten primaire tumoren zoals prostaat-, Long- en borstkanker kanker, met 20-25% van de patiënten ontwikkelen botmetastasen in de loop van ziekte1,2,3. In het bijzonder, dragen 70% van de borstkankerpatiënten bewijs van bot metastase op dood4. Tumor en stromale cellen interactie is essentieel voor de progressie van kanker in zowel primaire kanker en secundaire laesies. In de communicatie van het bot, is osteolytic botmetastasen van borstkanker afhankelijk van de oprichting van een pathologische vicieuze cirkel die zich voordoen tussen kankercellen, cellen van het bot en de bot-communicatie. Kankercellen verstoren bot evenwicht, toenemende bot resorptie5,6,7.
In normale en pathologische omstandigheden zijn osteoclasten de cellen die verantwoordelijk zijn voor bot resorptie, terwijl botcellen, in het deponeren van de nieuwe matrix, verantwoordelijk voor het nieuwe bot vorming8 zijn. Osteoclast activiteit wordt gereguleerd door botcellen door de uitdrukking van RANKL, dat aan de receptor rang op het oppervlak van de pre osteoclast bindt, inducerende pre osteoclast fusion, een noodzakelijk proces voor differentiatie in volwassen osteoclasten. De inductie van osteoclastogenesis verhoogt bot resorptie. Een groot aantal in vivo studies verbeterd ons begrip van bot metastase vorming9,10,11aanzienlijk. Borstkankercellen van de primaire tumor en in het bot communicatie erover bot homeostase, bevordering van osteoclastogenesis en bot resorptie8. In dit scenario zijn alle de moleculaire interacties die tussen kankercellen en osteoclasten plaatsvinden van cruciaal belang. Zoals reeds vermeld, heeft het mechanisme van metastase biomineralisatie in in vivo muizen modellen zijn opgehelderd. Naast de noodzaak voor de goedkeuring van alle in vivo dierproeven door de ethische commissie zijn er echter verscheidene andere nadelen aan het uitvoeren van in vivo experimenten met inbegrip van hoge kosten en tijdrovende methoden. Verschillende auteurs hebben gecombineerd preklinische in vivo en in vitro modellen van osteoclastogenesis met behulp van een lymfkliertest lijn van pre osteoclasten genaamd RAW246.79,10,11. De nadelen van dit model vloeien voort uit het feit dat de cellen zich al aan het worden pre osteoclasten en niet van menselijke oorsprong. Om deze redenen kon translationeel onderzoek sterk profiteren van de beschikbaarheid van in vitro volledig menselijk preklinische modellen om te studeren bot kanker cel interacties.
We een methode van osteoclastogenesis in vitro vanaf perifere bloed monsters12,13geoptimaliseerd. Osteoclasten ontlenen monocyten, die zijn aanwezig, zij het in een kleine graad, in perifeer bloedmonsters. Mononucleaire cellen worden eerst gescheiden van de erytrocyten en granulocyten in het bloed aanwezig door densiteitgradiënt dichtheid verloop; ze worden dan geselecteerd dankzij hun vermogen zich te houden aan het plastic substraat, in tegenstelling tot lymfocyten. Na het zaaien, de cellen worden gekweekt voor 14 dagen. MCSF en RANKL zijn de GFs door monocyten moeten eerst onderscheiden in macrofagen en vervolgens in de osteoclasten14,15. MCSF is nodig voor de gehele duur van de test, terwijl RANKL wordt gebruikt voor het opwekken van het proces van differentiatie in de late stadia van osteoclastogenesis. In de vroege fase van differentiatie helpt MCSF monocyten vermenigvuldigen en het overleven van14,15. Tijdens het tweede deel van osteoclastogenesis, cellen samensmelten en volwassen als osteoclasten, waarin de karakteristieke verdeling van actine F in ringen en het uiten van specifieke markers zoals tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) en calcitonine receptor (CTR) 14 , 15. onze methode bestaat uit het toevoegen van MCSF aan de monocyt cultuur voor de eerste 7 dagen van het experiment en een combinatie van MCSF en RANKL van 7 tot 14 dagen. Aan het einde van het experiment, wordt osteoclastogenesis geanalyseerd door het tellen van de gedifferentieerde cellen, zoals hieronder beschreven.
De culturen van de monocyt aangezet te onderscheiden door de GFs vormen de basis van ons preklinische model. We geoptimaliseerd een co cultuur systeem zonder GFs om de osteoclastogenic kracht van borstkankercellen beter te begrijpen. We een model van indirecte co culturen voor het eerst ontwikkeld door het toevoegen van een medium (80% α-minimaal essentiële Medium (α-MEM) en 20% geconditioneerd medium verzameld van een cultuur van borstkankercellen dat waren ongeveer 90% heuvels naar cellen ondergaan differentiatie12 . Het geconditioneerde medium (niet verzameld onder serum ontbering voorwaarden) werd verzameld na 24 uur en gemengd met verse medium bij een verhouding van 1:4. Het geconditioneerde medium veroorzaakte significante osteoclast differentiatie ten opzichte van de negatieve controle. Echter verbeterd wij zoals ik de informatie over de wederzijdse interactie tussen kankercellen en bot cellen verloren is gegaan bij het gebruik van indirecte co culturen, onze systeem door het uitvoeren van directe co culturen. We zaadjes kankercellen in 0.4 µM wordt ingevoegd en plaatste ze in putten waar mononucleaire cellen werden verguld. Met behulp van deze methode, cellen delen hetzelfde medium en wisselen secreted eiwitten. We dus een volledig mens preklinische model van osteoclastogenesis die zijn geïnduceerd door kanker cellen13gemaakt.
Dit systeem is zeer veelzijdig en kan worden gebruikt voor verschillende onderzoeksdoeleinden, bijvoorbeeldin farmacologische studies onderzoeken de rol van drugs in bot metastase. Ons model maakt het mogelijk om het onderzoek naar de werkzaamheid en de mechanismen van de actie van bot-gerichte therapieën en/of antitumorale geneesmiddelen in de communicatie van de bot in het bijzijn van kanker cellen13. U ontwerpt de experimenten met de juiste besturingselementen, gemakkelijker d.w.z., kankercellen en osteoclasten gekweekte individueel, te begrijpen de impact van de co-cultuur op drug activiteit. Deze aanpak wordt nog interessanter wanneer de drug bestudeerd richt zich op zowel kanker cellen en osteoclasten, bijvoorbeeldeverolimus16is. Dit model kan ook worden gebruikt ter identificatie van nieuwe trajecten van interactie tussen kankercellen en bot cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preklinische in vitro modellen bestuderen van de mechanismen van Overspraak tussen kankercellen en bot cellen zijn nodig om het identificeren van de mechanismen van bot metastase, die kan worden gebruikt voor het maken van nieuwe therapeutische strategieën. We ontwikkelden een model volledig mens in vitro van osteoclastogenesis uit menselijk perifere bloed (Figuur 3). Tijdens de optimalisatie van de methodologie, werden een aantal kritische punten geïdentificeerd en opgel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Yibin Kang voor het verstrekken van de cellijn van SCP2 en Cristiano Verna voor redactionele ondersteuning.
Materials
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
Riferimenti
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. Bone and cancer: the osteoncology. Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Roodman, G. D. Mechanisms of bone metastasis. N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
- Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).
- Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it’s all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
- Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
- Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).
- Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
- Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
- Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
- Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).
