Développement d’un humain modèle préclinique de Osteoclastogenesis de Monocytes du sang périphérique conjointement mis en culture avec des lignées cellulaires de Cancer du sein
Summary
Ce protocole décrit le développement d’un in vitro humain modèle préclinique d’osteoclastogenesis de monocytes du sang périphérique, cultivées avec des lignées de cellules cancéreuses du sein pour imiter l’interaction cellule-ostéoclastes de cancer. Le modèle pourrait être utilisé pour approfondir nos connaissances de la formation de métastases osseuse et améliorer les options thérapeutiques.
Abstract
La diaphonie entre les cellules tumorales et des cellules osseuses dans le microenvironnement osseux est essentielle pour comprendre le mécanisme de la formation de métastases osseuse. Nous avons développé un in vitro entièrement humain modèle préclinique d’une co-culture de cellules cancéreuses du sein et les monocytes en cours de différenciation vers les ostéoclastes. Nous avons optimisé un modèle d’osteoclastogenesis à partir d’un échantillon de sang périphérique provenant de donneurs sains. Les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) ont d’abord séparés par centrifugation en gradient de densité, injectées à une densité élevée et induites à se différencier en ajoutant deux facteurs de croissance (GFs) : activateur du récepteur du facteur nucléaire-κB ligand (RANKL) et macrophages facteur stimulant les colonies (MCSF). Les cellules ont été laissés dans la culture pendant 14 jours puis fixe et analysés par l’analyse en aval. Dans les métastases osseuses ostéolytiques, l’un des effets de l’arrivée de cellules du cancer dans l’OS est l’induction d’osteoclastogenesis. Ainsi, nous avons attaqué notre modèle avec co-cultures de cellules cancéreuses du sein afin d’étudier le pouvoir de différenciation des cellules cancéreuses à l’égard de GFs. Un moyen simple d’étudier l’interaction cellule-ostéoclastes cancer consiste à effectuer des co-cultures indirectes basées sur l’utilisation du milieu conditionné provenant de cultures de cellules de cancer du sein et mélangé avec un milieu frais. Ce mélange est ensuite utilisé pour induire la différenciation des ostéoclastes. Nous avons optimisé également une méthode de co-culture directe dans laquelle le cancer des cellules et des monocytes en cours de différenciation partagent le milieu et d’échangent des facteurs sécrétés. C’est une amélioration significative sur la méthode originale de co-culture indirecte car les chercheurs peuvent observer les interactions réciproques entre les deux types cellulaires et effectuer des analyses en aval pour les cellules cancéreuses et les ostéoclastes. Cette méthode nous permet d’étudier l’effet des drogues sur le microenvironnement osseux métastatique et aux lignées de cellules de semence autres que ceux provenant d’un cancer du sein. Le modèle peut également servir à étudier d’autres maladies comme l’ostéoporose ou d’autres maladies osseuses.
Introduction
L’OS est un site commun de métastase pour différents types de tumeurs primaires telles que le cancer de la prostate, du poumon et du sein, avec 20 à 25 % des patients présentant des métastases osseuses au cours de la maladie1,2,3. En particulier, 70 % des patientes atteintes de cancer portent témoignage de métastase osseuse à mort4. Tumeur et les cellules stromales interaction est essentielle pour la progression du cancer en cancer primitif et lésions secondaires. Dans le microenvironnement osseux, métastases osseuses ostéolytiques du cancer dépendent de la mise en place d’un cercle vicieux pathologique survenant entre cellules cancéreuses, les cellules osseuses et le microenvironnement osseux. Cellules cancéreuses perturbent l’équilibre osseuse, augmentation osseuse résorption5,6,7.
Dans des conditions normales et pathologiques, les ostéoclastes sont les cellules responsables de la résorption osseuse, tandis que les ostéoblastes, en déposant la nouvelle matrice, sont responsables de la formation8de l’OS nouveau. L’activité ostéoclastique est réglementée par les ostéoblastes à travers l’expression de RANKL, qui se lie à son récepteur RANK sur la surface des ostéoclaste, induisant des ostéoclaste avant la fusion, un processus nécessaire pour une différenciation des ostéoclastes matures. L’induction d’osteoclastogenesis augmente la résorption osseuse. Un grand nombre d’études in vivo ont considérablement amélioré notre compréhension des os métastase formation9,10,11. Cellules cancéreuses de la tumeur primaire et dans le microenvironnement osseux perturbent l’homéostasie osseuse, promotion osteoclastogenesis et8de la résorption des os. Dans ce scénario, toutes les interactions moléculaires qui se produisent entre les cellules cancéreuses et les ostéoclastes sont d’une importance cruciale. Comme nous l’avons déjà mentionné, le mécanisme de la formation de métastases osseuse a été élucidé dans les modèles de souris in vivo . Cependant, outre le fait que l’approbation de tous les in vivo l’expérimentation animale par le Comité d’éthique, il y a plusieurs autres inconvénients lorsque vous exécutez des expériences in vivo notamment les coûts élevés et des méthodes fastidieuses. Plusieurs auteurs ont combiné des modèles précliniques in vivo et in vitro d’osteoclastogenesis en utilisant une ligne murine des ostéoclastes pré appelé RAW246.79,10,11. Les inconvénients de ce modèle proviennent du fait que les cellules se sont déjà engagés à devenir des ostéoclastes et ne sont pas d’origine humaine. Pour ces raisons, la recherche translationnelle pourrait grandement bénéficier de la disponibilité de in vitro entièrement humain modèles précliniques pour étudier les interactions entre cellules de cancer osseux.
Nous avons optimisé une méthode d’osteoclastogenesis in vitro à partir des échantillons de sang périphérique humain12,13. Les ostéoclastes dérivent des monocytes, qui sont présents, bien que dans une faible mesure, dans des échantillons de sang périphérique. Les cellules mononucléaires sont d’abord séparés des érythrocytes et granulocytes présents dans le sang total par gradient de densité de gradient de Ficoll ; ils sont ensuite sélectionnés grâce à leur capacité à adhérer à un substrat en plastique, à la différence des lymphocytes. Après l’ensemencement, les cellules sont cultivées pendant 14 jours. MCSF et RANKL sont le GFs requis par les monocytes de différencier tout d’abord en macrophages, puis en ostéoclastes14,15. MCSF est nécessaire pendant toute la durée de l’essai, tandis que RANKL est utilisé pour induire le processus de différenciation dans les derniers stades d’osteoclastogenesis. Dans la phase précoce de la différenciation, MCSF aide monocytes proliférer et à survivre14,15. Au cours de la deuxième partie d’osteoclastogenesis, cellules fusionnent et matures comme les ostéoclastes, montrant la répartition caractéristique de l’actine F dans les anneaux et expriment des marqueurs spécifiques tels que les phosphatases acides tartrate-résistantes (TRAP) et récepteur calcitonine (CTR) 14 , 15. notre méthode consiste à ajouter le MCSF à la culture de monocyte pour les 7 premiers jours de l’expérience et une combinaison de MCSF et RANKL de jours 7 à 14. À la fin de l’expérience, osteoclastogenesis est analysée en comptant les cellules différenciées, comme détaillé ci-dessous.
Les cultures de monocyte induites à se différencier par GFs forment la base de notre modèle préclinique. Nous avons optimisé un système de co-culture sans GFs pour mieux comprendre le pouvoir d’osteoclastogenic des cellules cancéreuses du sein. Nous avons développé tout d’abord un modèle des co-cultures indirectes en ajoutant un support (80 % α-milieu essentiel Minimal (α-MEM) et 20 % conditionnée moyen prélevé une culture de cellules cancéreuses du sein qu’environ 90 % anastomosé aux cellules subissent la différenciation12 . Le milieu conditionné (non prélevé dans des conditions de privation de sérum) a été capturé après 24 heures et mélangé avec un milieu frais à une proportion de 1:4. Le milieu conditionné induite par différenciation ostéoclastique significative en ce qui concerne le contrôle négatif. Cependant, comme les informations sur l’interaction réciproque entre cellules cancéreuses et les cellules osseuses sont perdues lors de l’utilisation indirectes co-cultures, nous avons amélioré notre système en effectuant des co-cultures directs. Nous avons ensemencé des cellules cancéreuses à 0,4 µM insère et placés dans le puits où les cellules mononucléaires sont plaqués. En utilisant cette méthode, les cellules partagent le même milieu et échangent des protéines sécrétées. Ainsi, nous avons créé un modèle préclinique pleinement humain d’osteoclastogenesis induite par le cancer des cellules13.
Ce système est extrêmement souple et peut être utilisé à des fins de recherche différentes, par exemple, dans des études pharmacologiques sur le rôle des médicaments dans les métastases osseuses. Notre modèle permet d’étudier l’efficacité et les mécanismes d’action des thérapies ciblées OS et/ou médicaments antitumoraux dans le microenvironnement osseux en présence de cellules de cancer du13. Concevez les expériences avec les réglages corrects, c’est-à-dire, les cellules cancéreuses et les ostéoclastes cultivés individuellement, rend plus facile à comprendre l’impact de la co-culture sur drogues est très actif. Cette approche devient encore plus intéressante lorsque le médicament à l’étude vise les deux cancer des cellules et des ostéoclastes, par exemple, évérolimus16. Ce modèle peut également être utilisé pour identifier de nouvelles voies d’interaction entre les cellules cancéreuses et les cellules osseuses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des modèles précliniques in vitro étudie les mécanismes de la diaphonie entre les cellules cancéreuses et les cellules osseuses sont nécessaires pour identifier les mécanismes de la métastase osseuse qui peut être utilisé pour créer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons développé un modèle entièrement humain in vitro d’osteoclastogenesis de sang périphérique humain (Figure 3). Lors de l’optimisation de la méthodologie, un certain nombre …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Yibin Kang pour la fourniture de la lignée cellulaire de sep2 et Cristiano Verna pour aide à la rédaction.
Materials
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
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