Entwicklung eines menschlichen präklinischen Modell der Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten Co mit Brustkrebszelllinien kultiviert
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine in-Vitro menschliche präklinischen Modell des Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten kultiviert mit Brustkrebszelllinien, die Krebs Zelle Osteoklasten Interaktion zu imitieren. Das Modell könnte verwendet werden, um unser Verständnis der Metastasierung Knochenbildung und Therapiemöglichkeiten zu verbessern.
Abstract
Das Übersprechen zwischen Tumorzellen und Knochenzellen in die Knochen Mikroumgebung ist entscheidend für das Verständnis des Mechanismus der Metastasierung Knochenbildung. Wir entwickelte eine in-vitro- vollständig humaner präklinischen Modell Kokulturen von Brustkrebs-Zellen und Monozyten in der Differenzierung zu Osteoklasten. Wir optimieren ein Modell der Osteoclastogenesis ausgehend von einer Stichprobe von peripherem Blut von gesunden Spendern gesammelt. Peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) wurden zuerst durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung getrennt, bei einer hohen Dichte ausgesät und induziert durch das Hinzufügen von zwei Wachstumsfaktoren (GFs) zu unterscheiden: Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor κB Ligand (RANKL) und Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (MCSF). Die Zellen in der Kultur für 14 Tage blieben und dann fixiert und durch nachgelagerte Analyse analysiert. In osteolytischen Knochenmetastasen ist eine der Auswirkungen der Krebs Zelle Anreise in den Knochen der Induktion von Osteoclastogenesis. Wir herausgefordert damit unser Modell mit Ko-Kulturen von Brustkrebszellen, die Differenzierung macht der Krebszellen in Bezug auf GFs zu studieren. Eine einfache Möglichkeit des Studiums Krebs Zelle Osteoklasten Interaktion soll indirekten Co Kulturen basiert auf der Verwendung von konditionierten Medium von Brustkrebs Zellkulturen gesammelt und gemischt mit frischem Medium ausführen. Diese Mischung wird dann verwendet, um Osteoklasten Differenzierung zu induzieren. Wir haben auch eine Methode der direkten Kokultur in welcher Krebs Zellen und Monozyten in der Differenzierung des Mediums zu teilen und austauschen sezernierten Faktoren optimiert. Dies ist eine deutliche Verbesserung gegenüber der ursprünglichen indirekte Kokultur Methode, wie Forscher die gegenseitige Wechselwirkungen der beiden Zelltypen beobachten und nachgeschalteten für Krebszellen und Osteoklasten Analysen. Diese Methode ermöglicht es uns, die Wirkung von Medikamenten auf die Metastasen Knochen Mikroumgebung und Samen Zelllinien unternehmensfremde abgeleitet von Brustkrebs zu studieren. Das Modell kann auch verwendet werden, um andere Krankheiten wie Osteoporose oder andere Knochen-Bedingungen zu studieren.
Introduction
Knochen ist eine gemeinsame Website der Metastasierung für verschiedene Arten von primären Tumoren wie Prostata-, Lungen- und Brustkrebs Krebs, mit 20-25 % der Patienten entwickeln Knochenmetastasen im Verlauf der Krankheit1,2,3. 70 % der Patientinnen mit Brustkrebs durchgeführt, insbesondere, Nachweis von Knochenmetastasen bei Tod-4. Tumor und Stromazellen Zelle Interaktion ist wichtig für Krebsentwicklung im primären Krebs und sekundäre Läsionen. In den Knochen Mikroumgebung hängen osteolytischen Knochenmetastasen bei Brustkrebs die Einrichtung ein pathologischer Teufelskreis zwischen Krebszellen, Knochenzellen, und die Knochen Mikroumgebung. Krebszellen stören Knochen Gleichgewicht, Erhöhung der Knochenresorption5,6,7.
Unter normalen und pathologischen Bedingungen sind Osteoklasten die Zellen verantwortlich für Knochenabbau, während Osteoblasten in Hinterlegung neue Matrix für neue Knochen Bildung8verantwortlich sind. Osteoklasten-Aktivität wird durch Osteoblasten durch den Ausdruck von RANKL, die an seinen Rezeptor RANK auf der Pre-Osteoklasten Oberfläche bindet, Pre Osteoklasten Fusion, ein notwendiger Prozess zur Differenzierung in ausgereiften Osteoklasten induzieren geregelt. Die Induktion von Osteoclastogenesis erhöht Knochenabbau. Eine große Anzahl von in-Vivo -Studien haben unser Verständnis von Knochen Metastasen Bildung9,10,11deutlich verbessert. Brustkrebs-Zellen aus dem primären Tumor und in den Knochen Mikroumgebung Radardetektoren Knochen Homöostase, Förderung Osteoclastogenesis und Knochen Resorption8. In diesem Szenario sind alle molekularen Interaktionen, die auftreten, die zwischen Krebszellen und Osteoklasten von entscheidender Bedeutung. Wie bereits erwähnt hat der Mechanismus der Knochenbildung Metastasen in in Vivo Mäuse Modelle aufgeklärt. Neben der Notwendigkeit für die Zulassung von allen in Vivo Tierversuche durch die Ethik-Kommission sind jedoch einige andere Nachteile zur Durchführung von in-Vivo Experimenten einschließlich hohe Kosten und zeitaufwändige Methoden. Mehrere Autoren haben präklinische in Vivo und in Vitro Modellen von Osteoclastogenesis mittels einer murinen Linie von Pre Osteoklasten genannt RAW246.79,10,11kombiniert. Die Nachteile dieses Modells ergeben sich aus der Tatsache, dass die Zellen schon immer vor Osteoklasten verpflichtet und nicht menschlichen Ursprungs sind sind. Aus diesen Gründen profitieren translationaler Forschung stark von der Verfügbarkeit von in-vitro- vollständig humaner präklinischen Modellen, Knochen-Krebs-Zell-Interaktionen zu studieren.
Wir haben eine Methode des Osteoclastogenesis in Vitro menschliche peripherem Blut Proben12,13ab optimiert. Osteoklasten stammen aus Monozyten, die, wenn auch in geringem Umfang im peripheren Blutproben vorliegen. Mononukleäre Zellen werden zunächst von den Erythrozyten und Granulozyten im Vollblut von Ficoll Dichtegradient getrennt; Sie werden dann dank ihrer Fähigkeit zur Einhaltung der Kunststoff-Substrat, im Gegensatz zu Lymphozyten ausgewählt. Nach der Aussaat, sind Zellen für 14 Tage kultiviert. MCSF und RANKL sind die GFs geforderten Monozyten, zuerst in Makrophagen und dann in Osteoklasten14,15zu unterscheiden. MCSF braucht man für die gesamte Dauer des Tests, während RANKL verwendet wird, um den Differenzierungsprozess in den späten Stadien der Osteoclastogenesis induzieren. In der frühen Phase der Differenzierung hilft MCSF Monozyten vermehren und überleben14,15. Während des zweiten Teils der Osteoclastogenesis Zellen verschmelzen und Reifen als Osteoklasten, zeigt die charakteristische Verteilung der Aktin F in Ringe und mit dem Ausdruck spezifischer Marker wie Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) und Calcitonin-Rezeptor (CTR) 14 , 15. unsere Methode besteht darin, zusätzlich MCSF zu Monocyte-Kultur für die ersten 7 Tage des Experiments und eine Kombination aus MCSF und RANKL von 7 bis 14 Tage. Am Ende des Experiments wird Osteoclastogenesis analysiert durch zählen der differenzierten Zellen, wie unten aufgeführt.
Induziert durch GFs unterscheiden Monocyte-Kulturen bilden die Grundlage unserer präklinischen Modell. Wir optimieren eine Kokulturen-System ohne GFs, die Osteoclastogenic Kraft der Brustkrebs-Zellen besser zu verstehen. Wir zuerst entwickelt ein Modell der indirekten Co Kulturen durch Zugabe von einem Medium (80 % α-Minimal notwendig (α-MEM) und 20 % bedingt Medium gesammelt von einer Kultur des Brustkrebs-Zellen, dass ca. 90 % Zusammenfluss Zellen Differenzierung12 befanden . Die konditionierte Medium (nicht unter Serum Entbehrung Bedingungen gesammelt) wurde nach 24 Stunden gesammelt und gemischt mit frisches Medium mit einem Anteil von 1:4. Die konditionierte Medium induziert signifikante Osteoklasten Differenzierung im Hinblick auf die negativ-Kontrolle. Jedoch, wie die Informationen über die Wechselwirkung zwischen Krebszellen und Knochenzellen verloren geht, bei der Verwendung von indirekten Co Kulturen, wir unser System durch Durchführung von direkten Ko-Kulturen verbessert. Wir ausgesät Krebszellen in 0,4 µM fügt und legte sie in Brunnen wo Mononukleäre Zellen überzogen waren. Mit dieser Methode, Zellen teilen das gleiche Medium und sekretierten Proteine austauschen. Wir schuf damit ein vollständig humaner präklinisches Modell Osteoclastogenesis induziert durch Krebs Zellen13.
Dieses System ist vielseitig einsetzbar und eignet sich für verschiedene wissenschaftliche Zwecke, z. B.in pharmakologischen Studien zur Untersuchung der Rolle der Drogen in Knochenmetastasen. Unser Modell macht es möglich, die Wirksamkeit und Wirkmechanismen des Knochens zielgerichtete Therapien und/oder Antitumor-Drogen in den Knochen Mikroumgebung in Anwesenheit von Krebs Zellen13zu studieren. Versuchsplanung mit der richtigen Steuerung, macht d.h., Krebszellen und Osteoklasten kultiviert individuell, es leichter zu verstehen, die Auswirkungen der Co-Kultur auf Drogetätigkeit. Dieser Ansatz wird noch interessanter, wenn das zu untersuchende Medikament richtet sich an beide Krebs Zellen und Osteoklasten, z.B.Everolimus16. Dieses Modell kann auch verwendet werden, um neue Wege der Interaktion zwischen Krebszellen und Knochenzellen zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Präklinischen in-vitro- Modelle untersuchen die Mechanismen der Übersprechen zwischen Krebszellen und Knochenzellen sind erforderlich, um die Mechanismen der Knochenmetastasen zu identifizieren, die verwendet werden können, um neue therapeutische Strategien zu erstellen. Wir entwickelten ein vollständig humaner in Vitro -Modell der Osteoclastogenesis aus dem menschlichen peripheren Blut (Abbildung 3). Bei der Optimierung der Methodik wurden eine Reihe von kritischen Pun…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Yibin Kang für die Bereitstellung der SCP2-Zell-Linie und Cristiano Verna für redaktionelle Unterstützung danken.
Materials
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
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