말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

Summary

이 프로토콜 생체 외에서 인간 전 임상 모델의 주변 혈액 monocytes 배양 암 세포 osteoclast 상호 작용을 모방 하기 위해 유 방 암 세포 라인에서 osteoclastogenesis의 개발을 설명 합니다. 모델 뼈 전이 형성의 우리의 이해를 심화 하 고 향상 치료 옵션 사용 될 수 있습니다.

Abstract

종양 세포 및 뼈 세포 뼈 microenvironment에서 사이 누화 뼈 전이 형성의 메커니즘 이해 결정적 이다. 우리는 생체 외에서 완전히 인간의 전 임상 모델을 유방암 세포 및 osteoclasts로 차별화를 진행 하는 monocytes의 공동 문화를 개발 했다. 우리는 주변 혈액 건강 한 기증자 로부터 수집 된 샘플에서 시작 하는 osteoclastogenesis의 모델을 최적화. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) 처음 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 분리, 높은 밀도에서 시드 되었고 두 성장 인자 (GFs)을 추가 하 여 차별화 하는 유도: 핵 요인-κB ligand (RANKL) 및 대 식 세포의 수용 체 활성 콜로 니 자극 인자 (MCSF). 셀은 14 일 문화에 남아 다음 고정 고 다운스트림 분석 하 여 분석. Osteolytic 뼈 전이에 뼈에 암 세포 도착의 효과 중 하나는 osteoclastogenesis의 유도 이다. 우리는 따라서 GFs와 관련 하 여 암 세포의 분화 능력 연구 유방암 세포의 공동 문화 우리의 모델 도전. 암 세포 osteoclast 상호 작용을 공부 하는 간단한 방법 간접 공동 문화 조절된 매체 유 방 암 세포 배양에서 수집 하 고 신선한 매체와 혼합의 사용에 따라 수행 하는 것입니다. 이 혼합물 다음 osteoclast 차별화를 유도 하는 데 사용 됩니다. 우리는 또한 직접 공동 문화는 암에서 세포, monocytes 분화를 겪고 매체 공유와 분 비 요소를 교환 하는 방법을 최적화 합니다. 이것은 상당한 개선을 원래 간접 공동 문화 메서드를 통해 연구자는 두 종류의 세포 상호 작용을 관찰 하 고 암 세포와 osteoclasts 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 유방암에서 파생 된 씨 셀 라인을 전이성 뼈 microenvironment에 약물의 효과 연구 수 있습니다. 모델도 골다공증 또는 다른 뼈 조건 등 다른 질병 연구를 사용할 수 있습니다.

Introduction

뼈 질병^1,2,3의 과정에서 뼈 전이 개발 하는 환자의 20-25%와 폐, 유 방, 전립선 암, 등 기본 종양의 종류에 대 한 전이의 일반적인 사이트입니다. 특히, 유 방 암 환자의 70% 죽음⁴에서 뼈 전이의 증거를가지고. 종양 및 stromal 세포 상호 작용은 암 진행에 필수적인 기본 암에 보조 병 변. 뼈 microenvironment에서 유방암에서 osteolytic 뼈 전이 암 세포, 뼈 세포, 뼈 microenvironment 사이 발생 하는 병 적인 악순환의 설립에 따라 달라 집니다. 암 세포 뼈 재흡수^5,,67증가 뼈 균형을 방해.

정상 및 병 적인 조건에서 osteoclasts는 뼈 재흡수에 대 한 책임 셀 반면 osteoblasts, 입금 새로운 매트릭스에 새로운 뼈 대형⁸에 대 한 책임이 있습니다. Osteoclast 활동 RANKL, 사전 osteoclast 표면에 그것의 수용 체 순위를 바인딩하는 사전 osteoclast 퓨전, 차별화 성숙한 osteoclasts에 필요한 과정을 유도의 표현을 통해 osteoblasts에 의해 통제 된다. Osteoclastogenesis의 유도 뼈 재흡수를 증가합니다. Vivo에서 연구의 많은 수는 크게 뼈 전이 형성^9,,1011의 우리의 이해를 개선 했다. 유방암 세포 주 종양에서와 뼈 microenvironment에서 osteoclastogenesis 홍보 뼈 항상성 교란 하 고 뼈 재흡수⁸. 이 시나리오에서는 모든 분자 사이 상호 작용에 발생 하는 암 세포와 osteoclasts에 중요 한 중요성의. 이미 언급 했 듯이, vivo에서 쥐 모델에서 뼈 전이 형성의 메커니즘을 해명 되었습니다 했습니다. 그러나, 모든 vivo에서 동물 실험 윤리 위원회의 승인에 대 한 필요, 이외에 높은 비용 및 시간이 걸리는 방법을 포함 vivo에서 실험을 수행 하는 것 다른 몇 가지 단점이 있다. 몇몇 저자는 사전 osteoclasts 라는 RAW246.7^9,,1011의 murine 라인을 사용 하 여 osteoclastogenesis의 전 임상 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델을 결합 했다. 이 모델의 단점이 사실 셀 이미 사전 osteoclasts 되기 위해 최선을 다하고 있습니다 및 인간 근원의 하지 않습니다에서 줄기. 이러한 이유로, 변환 연구는 생체 외에서 완전히 인간의 전 임상 모델의 뼈 암 세포 상호 작용을 공부 하 여부에서 크게 유익할 수 있었다.

우리 osteoclastogenesis에서 생체 외에서 인간 주변 혈액 샘플^12,13에서 시작 하는 방법을 최적화 합니다. Osteoclasts는 monocytes는 존재, 이기는 하지만 작은 정도에, 말 초 혈액 샘플에서에서 파생. 단 세포는 먼저 구분 granulocytes 전체 혈액에 존재 하 고 적혈구에서 Ficoll 밀도 기울기; 그들은 다음 세포와 달리 플라스틱 기판에 그들의 능력 덕분에 선택 됩니다. 시드, 후 셀 14 일 동안 교양. MCSF 및 RANKL GFs monocytes에 먼저 대 식 세포로 그리고 osteoclasts^14,15차별화 하는 데 필요한 있습니다. RANKL은 osteoclastogenesis의 후반 단계에서 분화 과정을 유도 하는 데 사용 됩니다 반면 MCSF의 분석 결과, 전체 기간 동안 필요 합니다. 차별화의 초기 단계에서 MCSF monocytes 증식 및^14,15살아남을 수 있습니다. Osteoclastogenesis의 두 번째 부분에서, 세포 융합 및 osteoclasts, 고리에 걸 F의 특성 분포를 보여 주는 및 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정), 칼 시 토 닌 수용 체 등 특정 마커를 표현으로 성숙 (CTR) ^{14 , 15}. 우리의 방법을 일 7 ~ 14에서에서 실험 및 MCSF와 RANKL의 첫 번째 7 일 동안 monocyte 문화에 MCSF를 추가 구성 됩니다. 실험의 끝에, osteoclastogenesis로 아래 차별화 된 셀을 계산 하 여 분석 된다.

GFs에 의해 분화를 유도 하는 monocyte 문화는 우리의 전 임상 모델의 기초를 형성 한다. 우리 유방암 세포의 osteoclastogenic 힘을 더 잘 이해 하는 GFs 없이 공동 문화 시스템 최적화. 우리가 먼저 개발 간접 공동 문화 매체를 추가 하 여 (80% α-최소한의 필수 매체 (α-MEM)와 20% 조절 매체에서에서 수집 된 유방암 세포의 문화는 했다 셀에 약 90% 합칠 겪고 차별화¹² . (혈 청 부족 조건 하에서 수집 되지 않습니다) 바른된 매체 24 시간 후 수집 된 고 1: 4의 비율에 신선한 매체와 혼합. 바른된 매체 부정적인 제어에 관하여 상당한 osteoclast 차별화를 유도 한다. 그러나, 암 세포 및 뼈 세포 간의 상호 상호 작용에 대 한 정보는 손실 간접 공동 문화를 사용 하는 경우, 우리는 개선 우리의 시스템 직접 공동 문화를 수행 하 여. 우리는 0.4 µ M 삽입 및 단 세포 도금 했다 우물에 그들을 배치에서 암 세포를 시드. 이 메서드를 사용 하 여 셀 같은 매체를 공유 하 고 분 비 단백질을 교환 한다. 우리는 따라서 osteoclastogenesis 암 세포¹³에 의해 유도 된의 완전히 인간의 전 임상 모델을 만들었습니다.

이 시스템은 매우 다재 다능 하 고 다른 연구 목적, 예를 들면, 뼈 전이에 약물의 역할을 조사 하는 약리 연구에 사용 될 수 있습니다. 우리의 모델 효능과 뼈-타겟 요법 암 세포¹³의 뼈 microenvironment에 antitumor 약물의 행동의 메커니즘을 연구를 가능 하 게. 올바른 컨트롤 실험 설계, 즉, 암 세포와 개별적으로 경작 osteoclasts 쉽게 마약 활동에 공동 문화에 미치는 영향을 이해 하는 것 있습니다. 이 이렇게 공부 되 고 마약 대상 모두 암 세포와, 예를 들어, osteoclasts everolimus¹⁶때 더욱 흥미로운 됩니다. 이 모델은 또한 암 세포 및 뼈 세포 사이 상호 작용의 새로운 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Protocol

인간 osteoclasts 준 서 면된 동의 연구에 참여 하는 건강 한 기증자의 PBMCs에서 분화 되었다. 연구 프로토콜 1964 헬싱키 선언에서 윤리적인 표준 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 1. osteoclast 차별화 참고: EDTA에 건강 한 인간 기증자 로부터 말 초 혈액 이나 버 피 코트를 수집. 말 초 혈액의 미만 20 mL를 사용 하지 마십시오. 버 피 코트는 들은 단 세포의 더…

Representative Results

메서드는 쉽게 인간의 말 초 혈액에 monocytes osteoclasts를 구별 하기 위해 최적화 되었다. Monocyte 문화 암 세포, 암 세포의 뼈 전이에 osteoclastogenesis를 유지 할 수 있다 (문학18에서 같이) 확인을 경작 했다. Osteoclasts 암 세포에서 분화 하 고 GFs는 그림 1에 나와 있습니다. Osteoclast 같은 셀 있는 셀 4 이상의 핵 이며 트랩 (보라색 세포를) 얼룩…

Discussion

모델 전 임상 시험관에 암 세포 및 뼈 세포 사이 누화의 메커니즘을 공부 하 고 새로운 치료 전략을 만드는 데 사용할 수 있는 뼈 전이의 메커니즘을 식별 하기 위해 필요 합니다. 우리는 모델을 완벽 하 게 인간의 생체 외에서 인간 주변 혈액 (그림 3)에서 osteoclastogenesis의 개발. 방법론의 최적화 하는 동안 중요 한 포인트의 번호 식별 하 고 해결 했다. 첫 번째 씨…

Materials

αMEM	Euroclone	BE12-169F
Glutamine	Life-technologies	ECB3000D
Fetal bovine serum	Life-technologies	ECS0180DPR
hMCSF	Peprotech	300-25	Storage indications must be respected
hRANKL	Peprotech	310-01	Storage indications must be respected
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma Aldrich	387 A
Lymphocyte separation media	Biowest	L0560-100
Red Blood cell lysing buffer	SIgma	11814389001 ROCHE
Trypsin	EuroClone	COD. ECB3052D
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	157-4-100
MDA-MB-231 cell line	ATCC	CRM-HTB-267
MCF7	ATCC	HTB-22
Transwell	Corning	3470-Clear	These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size