Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi
Summary
Bu iletişim kuralı bir vitro insan preklinik modeli osteoclastogenesis kanser hücre-Osteoklast etkileşimi taklit etmek için meme kanseri hücre hatları ile kültürlü periferik kan monosit üzerinden gelişimi anlatılmaktadır. Model kemik metastaz oluşumunu anlayışımız daha fazla ve tedavi olanakları geliştirmek için kullanılabilir.
Abstract
Tümör hücreleri ve kemik microenvironment kemik hücreleri arasında çapraz karışma kemik metastaz oluşumunu mekanizmasını anlamak için önemlidir. Meme kanseri hücreleri ve farklılaşma Osteoklastlar doğru geçiren monosit ortak bir kültürün bir vitro tamamen insan preklinik modeli geliştirdik. Periferik kan sağlıklı bağışçılardan toplanan başlayarak osteoclastogenesis modeli en iyi duruma getirilmiş. Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından ayrılmış ilk, yüksek yoğunluklu seribaşı ve iki büyüme faktörleri (GDS) ekleyerek ayırt etmek için indüklenen: reseptör aktivatör nükleer faktör-κB ligand (RANKL) ve makrofaj Koloni uyarıcı faktör (MCSF). Hücreleri kültüründe 14 gün boyunca yaptı ve sonra sabit ve aşağı akım analizi ile analiz. Osteolitik kemik metastazı osteoclastogenesis indüksiyon etkileri kemik kanseri hücre varış biridir. Biz böylece meme kanseri hücreleri kanser hücrelerinin GFs ile ilgili olarak ayırt etme gücünü çalışmaya ortak kültürleri modelimizle meydan. Kanser hücre-Osteoklast etkileşim okuyan bir kolay yolu meme kanseri hücre kültürleri toplanan ve taze orta ile karışık şartına orta kullanımı dayalı dolaylı ortak kültürler gerçekleştirmektir. Bu karışım daha sonra Osteoklast farklılaşma ikna etmek için kullanılır. Biz de en iyi duruma getirilmiş bir yöntem hangi kanser hücreleri ve başkalaşım geçiren monosit orta paylaşmak ve salgılanan etkenler Döviz doğrudan ortak kültür. Araştırmacılar iki hücre tiplerinin karşılıklı etkileşimleri gözlemlemek ve kanser hücreleri ve Osteoklastlar için aşağı akım çözümlemesi gibi özgün dolaylı ortak kültür yöntemi üzerinde önemli bir gelişme bu. Bu yöntem metastatik kemik microenvironment ve tohum hücrenin satırlarına meme kanserinden türetilmiş dışındaki ilaçlar etkisini incelemek bize sağlar. Modeli de diğer hastalıklar gibi Osteoporoz veya diğer kemik koşulları incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Kemik metastaz kemik metastazı hastalığı1,2,3boyunca gelişen hastaların % 20-25 ile birincil tümörler prostat, akciğer ve göğüs kanseri gibi farklı türleri için ortak bir sitedir. Özellikle, meme kanserli hastalarda % 70’i ölüm4‘ de kemik metastaz kanıtı taşımak. Tümör ve stromal hücre etkileşim birincil kanser ve ikincil Lezyonlar kanser ilerlemesi için gerekli. Kemik microenvironment osteolitik kemik metastazı meme kanseri kanser hücreleri, kemik hücreleri ve kemik microenvironment arasında meydana gelen patolojik bir kısır döngü kurulması bağlıdır. Kanser hücreleri kemik rezorpsiyonu5,6,7artan kemik dengesini bozabilir.
Yeni Matris, para yatırmak içinde dokusunu, yeni kemik oluşumu8için sorumlu ise normal ve patolojik koşullarda Osteoklastlar kemik rezorpsiyonu için sorumlu hücrelerdir. Osteoklast etkinlik dokusunu aracılığıyla onun reseptör sırası öncesi Osteoklast yüzeyinde bağlar, ön Osteoklast füzyon, olgun Osteoklastlar içine farklılaşması için gerekli bir işlem inducing RANKL, ifade tarafından düzenlenmiştir. Osteoclastogenesis indüksiyon kemik rezorpsiyonu artırır. Vivo çalışmalar çok sayıda anlayışımız kemik metastaz oluşumu9,10,11önemli ölçüde iyileştirilmiştir. Meme kanseri hücrelerinin birincil tümör ve kemik microenvironment osteoclastogenesis teşvik kemik Homeostazı, huzursuz ve kemik rezorpsiyonu8. Bu senaryoda, ortaya çıkan tüm moleküler arasındaki etkileşimler kanser hücreleri ve Osteoklastlar çok önemli önemlidir. Zaten belirtildiği gibi kemik metastaz oluşumunu mekanizmasının vivo içinde fare modellerinde aydınlatılmamıştır. Ancak, tüm in vivo hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanması gereksiniminin yanı sıra, in vivo deneyler yüksek maliyetler ve zaman alıcı yöntemleri de dahil olmak üzere performans çeşitli dezavantajları vardır. Birden çok yazar öncesi Osteoklastlar RAW246.79,10,11denilen bir fare satırını kullanarak osteoclastogenesis preklinik in vivo ve in vitro modelleri birleştirdik. Bu model sakıncaları hücreleri zaten öncesi Osteoklastlar olmaya kararlı olan ve insan kaynağı değildir aslında kaynaklanıyor. Bu nedenlerden dolayı translasyonel araştırma kemik kanseri hücre etkileşimleri çalışmaya vitro tamamen insan preklinik modelleri kullanılabilirliğini büyük ölçüde yarar.
Osteoclastogenesis vitro insan periferik kan örnekleri12,13başlayarak yöntemi en iyi duruma getirilmiş. Periferik kan örneklerinde var, olmayan bir küçük ölçüde de olsa, monosit, Osteoklastlar kaynaklanmaktadır. Mononükleer hücreler eritrositler ve granülosit tam kan içinde mevcut gelen ilk Ficoll yoğunluk gradient tarafından ayrılır; Onlar o zaman aksine lenfositler plastik yüzey uygun yeteneği sayesinde seçilir. Tohum sonra hücre için 14 gün kültürlü. MCSF ve RANKL monosit tarafından ilk makrofajlar ve sonra içine Osteoklastlar14,15ayırt etmek için gereken GFs vardır. RANKL farklılaşma süreci osteoclastogenesis geç dönemlerinde ikna etmek için kullanılır, ancak MCSF testin süresi boyunca gereklidir. Farklılaşma erken aşamasında MCSF çoğalırlar ve14,15hayatta monosit yardımcı olur. Osteoclastogenesis ikinci bölümü sırasında hücreleri birlikte sigorta ve yüzükler aktin F karakteristik dağılımını gösteren ve tartarat dayanıklı asit fosfataz (tuzak) ve Kalsitonin reseptör gibi belirli işaretleri ifade Osteoklastlar olarak olgun (TO) 14 , 15. bizim yöntem MCSF monosit kültür deneme ve bir arada MCSF ve RANKL ilk 7 gün 7-14 gün sonra ekleyerek oluşur. Deneme sonunda osteoclastogenesis farklılaşmış hücreler, aşağıda açıklandığı gibi sayılarak analiz edilir.
GFs tarafından ayırt etmek için indüklenen monosit kültürler preklinik modelimiz temelini oluşturur. Ortak kültür sistemi olmadan GFs meme kanseri hücrelerinin osteoclastogenic gücünü daha iyi anlamak için en iyi duruma getirilmiş. Biz ilk geliştirilen bir model dolaylı ortak kültürlerin bir orta ekleyerek (% 80 α-en az gerekli orta (α-MEM) ve % 20 şartına orta toplanan meme kanseri hücrelerinin bir kültür yaklaşık % 90 birleşmesi hücrelere farklılaşma12 geçirmekte olduğunu . (Serum yoksunluğu koşullar altında toplanan değil) şartına orta 24 saat sonra toplanan ve bir oran 1:4, taze orta karışık. Klimalı orta negatif kontrol ile ilgili olarak önemli Osteoklast farklılaşma indüklenen. Kanser hücreleri ve kemik hücreleri arasındaki karşılıklı etkileşimi hakkında bilgi kayıp olarak dolaylı ortak kültürler kullanırken, ancak, biz bizim sistemi doğrudan ortak kültürler taşıyarak geliştirilmiş. Kanser hücreleri µM ekler ve wells nerede mononükleer hücreler kaplama yerleştirdiler 0,4 numaralı seribaşı. Bu yöntemi kullanarak, hücreleri aynı ortamı paylaşmak ve salgılanan proteinler değişimi. Böylece kanser hücreleri13tarafından indüklenen osteoclastogenesis tamamen insan preklinik modeli yarattık.
Bu sistem son derece çok yönlü ve farklı araştırma amaçlı, örneğin, farmakolojik çalışmalar kemik metastaz uyuşturucu rolünün araştırılması için kullanılabilir. Bizim model çalışma etkinliği ve mekanizmaları eylem kemik hedefli tedaviler ve/veya kemik microenvironment kanser hücreleri13huzurunda antitümör ilaçların olanak sağlar. Doğru kontroller ile deney tasarımı, Yani, kanser hücrelerinin ve tek tek, kültürlü Osteoklastlar yapar uyuşturucu faaliyeti hakkında ortak kültür etkisini anlamak daha kolay. Her iki kanser hücreleri ve Osteoklastlar, örneğin, everolimus16okudu uyuşturucu hedefleyen bu yaklaşım daha da ilginç hale gelir. Bu model de kanser hücreleri ve kemik hücreleri arasındaki etkileşimin yeni yollar tanımlamak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanser hücreleri ve kemik hücreleri arasında çapraz karışma mekanizmaları eğitim preklinik vitro modelleri yeni tedavi stratejileri oluşturmak için kullanılan kemik metastaz mekanizmaları tanımlamak için gereklidir. Osteoclastogenesis insan periferik kan (şekil 3) üzerinden tamamen insan vitro modeli geliştirdik. Metodoloji en iyileştirme sırasında bir dizi kritik noktaları tespit ve giderilir. İlk tohum mononükleer hücrelere miktarı ilgili. Lenfosi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yibin SCP2 hücre kültürünü sağlamak için Kang ve Cristiano Verna Editör Yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
Riferimenti
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. Bone and cancer: the osteoncology. Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Roodman, G. D. Mechanisms of bone metastasis. N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
- Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).
- Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it’s all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
- Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
- Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).
- Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
- Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
- Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
- Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).
