Summary
Este protocolo ilustra los pasos consecutivos importantes requeridos para evaluar la importancia del monitoreo de parámetros de vitalidad y procesos de reparación del ADN en la reactivación de las esporas de Bacillus subtilis después del tratamiento con plasma de baja presión por seguimiento proteínas a través del tiempo-resolved de la microscopia confocal y microscopía electrónica de barrido de reparación del ADN marcado con fluorescencia.
Abstract
Esterilización de plasma es una alternativa prometedora a métodos convencionales de esterilización industrial, clínico, y vuelos espaciales. Descargas de plasma (LPP) de baja presión contienen un amplio espectro de especies activas, que conducen a la rápida inactivación microbiana. Para estudiar la eficacia y los mecanismos de esterilización por LPP, utilizamos las esporas del organismo prueba Bacillus subtilis debido a su extraordinaria resistencia contra procedimientos de esterilización convencionales. Se describe la producción de monocapas de esporas B. subtilis , el proceso de esterilización por plasma de baja presión en un reactor de plasma inductivamente acoplado doble, la caracterización de la morfología de la espora mediante microscopía electrónica (SEM) y la Análisis de germinación y consecuencia de esporas por microscopía de células vivas. Un objetivo importante de especies de plasma es material genómico (DNA) y la reparación de lesiones de DNA inducida por plasma al renacimiento de la espora es crucial para la supervivencia del organismo. Aquí, estudiamos la capacidad de germinación de las esporas y el papel de ADN reparación durante la germinación de las esporas y consecuencia después del tratamiento con LPP por seguimiento marcado con fluorescencia ADN reparación proteínas (RecA) con microscopía de fluorescencia confocal tiempo resuelto. Tratados y monocapas de espora sin tratar son activadas para la germinación y visualizarse con un microscopio confocal invertido vivo de la célula con el tiempo a seguir la reacción de esporas individuales. Nuestras observaciones revelan que la fracción de germinación y rebasar las esporas depende de la duración del tratamiento de LPP llegando a un mínimo después de 120 s. RecA-YFP (proteína de la fluorescencia amarilla) fluorescencia fue detectada solamente en algunas esporas y desarrollada en todas rebasar las células con una elevación leve de las esporas tratadas con LPP. Por otra parte, algunas de las bacterias vegetativas derivan de esporas LPP tratados mostraron un aumento en el citoplasma y tendían a lyse. Los métodos descritos para el análisis de esporas individuales podrían ser ejemplares para el estudio de otros aspectos de la germinación de las esporas y consecuencia.
Introduction
Una meta importante de la exploración espacial es la búsqueda de firmas de las formas de vida y biomoléculas en otros cuerpos planetarios y lunas de nuestro sistema solar. La transferencia de microorganismos o biomoléculas de origen terrestre a las áreas críticas de exploración es de particular riesgo para impactar el desarrollo y la integridad de las misiones de detección de vida en cuerpos planetarios como Marte y Europa1. Las normas internacionales de protección planetaria, establecida por el Comité de investigaciones espaciales (COSPAR) en 1967, imponer regulaciones estrictas en misiones tripuladas y robóticas a otros planetas, sus lunas, asteroides y otros cuerpos celestes y regular la limpieza y esterilización de una nave espacial y componentes de hardware crítico previo para poner en marcha con el fin de eliminar contaminantes microorganismos terrestres y evitar la contaminación cruzada de los cuerpos celestes2. En la última década, la aplicación de plasma no térmico ha ganado gran atención en la investigación biomédica y nutricional, así como en vuelos espaciales tripulados aplicaciones3,4,5. Esterilización de plasma es una alternativa prometedora distinta a los métodos convencionales de esterilización ya que ofrece rápido y eficaz de inactivación microbiana6, mientras que siendo suave para sensibles y materiales lábiles al calor. Descargas de plasma contienen una mezcla de agentes reactivas como los radicales libres, partículas cargadas, neutral/excitado átomos, fotones de la radiación ultravioleta (UV) y el espectro de vacío ultravioleta (VUV) que conducen a la rápida inactivación microbiana3. En este estudio, utilizamos plasma de baja presión generada por la doble fuente de plasma acoplado inductivamente de baja presión (fenotipo)7,8 para inactivar las endosporas de Bacillus subtilis distribuidas en la superficie de ensayo de vidrio.
Bacterias Gram-positivas de la familia Bacillaceae están ampliamente distribuidas en hábitats naturales de suelo, sedimentos y aire, así como en ambientes inusuales tales como instalaciones de sala limpia y la estación espacial internacional9,10 ,11. La característica más distintiva del género Bacillus es la capacidad para formar endosporas latentes muy resistentes (en lo sucesivo como esporas) para sobrevivir condiciones desfavorables, tales como agotamiento de nutrientes12. Las esporas son generalmente mucho más resistentes que sus homólogos de la célula vegetativa a una variedad de tratamientos y de presiones ambientales, incluyendo calor, UV, radiación gamma, desecación, perturbaciones mecánicas y productos químicos tóxicos, tales como oxidantes fuertes o agentes de cambio de pH (revisados en referencias13,14) y por lo tanto, son objetos ideales para probar la eficacia de los métodos de inactivación microbiana. Puesto que el ADN genómico es un objetivo importante del tratamiento plasma de bacterias15,16, la reparación de las lesiones de DNA inducida por plasma (por ejemplo, rompe la doble cadena de ADN) en esporas avivamiento es crucial para la supervivencia de las bacterias13, 17.
Así, estudiamos la capacidad de germinación de las esporas y el papel de la reparación de la DNA durante la germinación de las esporas y consecuencia después de tratar las esporas con plasma de argón de baja presión por esporas individuales siguientes y reparar su expresión de ADN marcado con fluorescencia proteína RecA con microscopía de fluorescencia confocal tiempo resuelto. Le damos una instrucción paso a paso de la preparación de esporas B. subtilis en monocapas para lograr resultados reproducibles, el tratamiento de las monocapas de espora con plasma de baja presión para la esterilización, la preparación de plasma tratado esporas para evaluación ultraestructural mediante microscopía electrónica (SEM) y análisis de microscopía de células vivas en el nivel de esporas individuales en concierto con el monitoreo del ADN activado reparación de procesos que ocurren dentro de la célula en respuesta al tratamiento de plasma.
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Protocol
1. producción de esporas de bacillus subtilis y purificación
- Para la producción de esporas, transferir una cultura noche 5 mL de la cepa B. subtilis , suplementado con antibióticos apropiados, al medio de esporulación Schaeffer líquido de 200 mL de doble resistencia (por litro caldo nutritivo de 16 g, KCl 2 g, 0,5 g de MgSO 4* 7 H2O, 2 mL 1 M Ca (NO3)2, 2 mL 0.1 M MnCl2 * • 4 H2O, 1 mM 2 mL FeSO4, 2 mL de glucosa 50% (w/v)18) y cultivar con aireación vigorosa a 37 ° C por 72 h o hasta > 95% de la cultura ha esporulado. Se utilizan las esporas de las cepas siguientes: B. subtilis PY79 (tipo salvaje) B. subtilis PY79ΔrecA:: neo (deficiencia de la proteína de reparación de ADN RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp:: cat (RecA fundido con amarillo proteína fluorescente [YFP]19).
- Recoger esporas por centrifugación durante 15 minutos a 3.000 x g en tubos de 50 mL y purificar las muestras de lavado repetido los pasos (hasta 15 veces) mediante estéril destilada H2O y verifique estado de pureza y germinación por microscopia de contraste de fase. Asegúrese de que suspensiones de esporas consisten de esporas de la fase luminosa (> 99%) y están libres de células vegetativas (barras), las esporas germinadas (aspecto negro / gris) y restos de células, de lo contrario más experimentos de microscopia pueden ser disturbados. Lavar la muestra hasta que se alcanza la pureza deseada.
- Determinar la concentración de esporas por chapado a 50 μl de las diluciones seriadas 10 veces en LB-agar (es decir: uso 30 μl de muestra + 270 μl de agua estéril para un 1:10 dilución. Tomar 30 μl de la dilución particular a 270 μl de H2O para una dilución de 1: 100 y así sucesivamente) para calcular la UFC (unidades formadoras de colonias) e Incube las placas a 37 ° C durante la noche. Después de la determinación de UFC, ajustar la muestra a 109 esporas / mL de concentrar o diluir con agua estéril.
2. preparación de esporas depositadas en Aerosol Bacillus subtilis
Nota: La acumulación y superposición de las esporas pueden dar sombrear efectos durante el tratamiento, resultando en la cinética de inactivación falsificados. Para minimizar este problema, preparar muestras de esporas por una técnica de deposición de aerosoles20. Brevemente, controlar el inyector de dos sustancias de alta precisión con un contador de tiempo eléctrico que regula el rendimiento líquido en conjunto con el flujo de gas portador presurizado (aquí N2). Dispersar la muestra líquida inyectada a través de la boquilla usando la corriente de gas nitrógeno.
- Coloque un portador de muestras en forma de diapositivas microscópicas esterilizadas (para cinética de supervivencia) o redonda 25 mm cubreobjetos (fluorescente seguimiento de la reparación del ADN procesos/cLSM; microscopía de láser confocal) dentro el aerosol eléctricamente funcionado rociando la unidad en la alineación de la boquilla. La concentración de esporas usadas debe corresponder a un céntuplo de la concentración final deseada.
- Transferir 1 mL del cultivo de esporas a la entrada de boquilla de fluido e iniciar el proceso de pulverización de 0,1 s a una presión de 1,3 bar. La suspensión de esporas rociado (1 x 107) forma una fina película en la diapositiva microscópica que se seca rápidamente en segundos para formar una monocapa de espora uniformemente distribuidas. Almacenar los portadores de la muestra tratada en un recipiente estéril a temperatura ambiente.
3. baja presión Plasma tratamiento
- Preparar el sistema de plasma para el tratamiento de muestras biológicas y operar el sistema en 5 Pa con plasma de argón de 500 W durante 5 minutos. Por esto, todas las superficies en el sistema de limpiado y calentadas. Esto reduce pegarse de las moléculas del aire ambiente, es decir, nitrógeno, oxígeno y agua, mientras que el sistema de ventilación. Tras el pretratamiento del sistema, la cámara de ventilación y coloque cuidadosamente las muestras en el centro de la vasija del reactor con la ayuda de estantes de vidrio.
- Utilice al menos tres réplicas biológicas. Cerrar la cámara y evacuar por debajo de 2 PA llenar luego, el gas de proceso en la cámara. Regulan la presión en el sistema a 5 PA.
- Después del tiempo de proceso definido, el suministro de energía y gas y ventilación cuidadosamente el sistema para evitar soplar las muestras de lo portamuestras. Después de la ventilación, quite las muestras y colocar las muestras para el siguiente parámetro en el sistema. De controles tratados de plasma no exponen las muestras al vacío sólo (5 Pa) en presencia de los gases de proceso equivalente a la vez más aplicada del plasma.
4. recuperación y evaluación de la supervivencia de la espora
- Preparar una solución de autoclave 10% acetato de polivinilo (PVA) y cubrir el portamuestra con aproximadamente 500 μl y dejarlos al aire para 4 h. tira apagado la capa seca de PVA (ahora contiene la muestra de esporas) utilizando pinzas estériles y transfiera 2 ml tubo de reacción. Añadir 1 mL de agua estéril en el tubo y disolver la capa PVA mediante Vortex. Este procedimiento conduce a > 95% de recuperación de esporas y no afecta a su capacidad de germinación21.
- En serie, diluir la muestra a 1:10 en agua estéril en una placa de 96 pocillos (es decir, 270 μl estériles H2O + dilución de muestra/ex 30 μL). Placa de 50 μl de cada dilución en agar nutritivo caldo de lisogenia (LB), incubar las placas a 37 ° C durante una noche y enumerar el número de colonias crecidas (UFC).
5. vivo microscopia celular y seguimiento de los procesos de reparación del ADN en la germinación de esporas
- Para los experimentos de germinación, preparación de un 1 mm espesor 1,5% LB-agar pad, hirviendo 700 μl de medio y pipeta en una caja de Petri estéril de la microscopia. Después de 10 min, corte un 8 x 8 mm x 1 pad mm LB-agar con un bisturí estéril y transferir el agar cuidadosamente sobre las monocapas de la espora que descansan sobre cubreobjetos de vidrio de 25 mm.
Nota: Este paso es crucial para la visualización de esporas individuales y permitir después su reacción hacia la activación de la germinación inducida por el agar nutriente. Así, el LB-agar sirve dos propósitos, (1) fijar las esporas en la superficie, que evita la relocalización a lo largo de la superficie y fuera de foco óptico y (2) activar la espora para germinar. - Después de cubrir la muestra con el agar, transferir el cubreobjetos de vidrio rápidamente en una proyección de imagen de cámara y microscopio las muestras con un microscopio de escaneo láser confocal automatizado con óptica invertida con un 63 X / 1.3 plano apocromática objetivo de inmersión de aceite.
-
Realizar la proyección de imagen de fluorescencia (YFP) con una excitación puede detectarse entre 520 y 560 nm longitud de onda de 514 nm y de emisión.
- Grabar imágenes de campo claro en modo usando uno de los multiplicadores de la foto (ruta de la luz transmitida) de exploración.
- Grabar serie de Time-lapse con una energía del laser del 2,6% y ajuste la abertura confocal a 5 unidades luminosas y con una frecuencia de muestra de 1 marco por 30 s de 0 h a 5 h, según el experimento. Es de destacar que altas dosis de monocromática láser iluminación a 514 nm inhibir totalmente la germinación (figura 1A, B).
- Mantener las muestras a 37 ° C (humedad del aire ambiente) en una fase de calentamiento durante el proceso de proyección de imagen. Utilice al menos tres réplicas biológicas para cada condición. En el caso de agregación de la espora, espora varias capas distribución o contaminación por partículas de polvo, bloqueo del tratamiento de plasma ("sombreado") podría ocurrir y permitir la germinación de las esporas sombreadas (figura 1C, D).
Figura 1: posibles problemas observaron durante la microscopía de fluorescencia confocal vivo de la célula de plasma tratado esporas. (A, B) Inhibición de la germinación de las esporas por altas dosis de monocromático (514 nm) láser de iluminación. (A) Resumen (3 x 3 cuadros cosidos) de B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) esporas 180 min después de la iniciación de la germinación. El marco en el medio fue expuesto a intervalos 30 s a altas dosis de luz láser (514 nm, energía del laser de 70%), mientras que las regiones circundantes (= Marcos) no fueron iluminadas (imagen fusionada de canal de campo claro y fluorescencia de RecA-YFP; ordenó las estructuras causados por el uso de platos con una cuadrícula impresa 500 μm la proyección de imagen de 35 mm). (B) muestra un 4 X vista magnificada de la frontera entre la región iluminada y no iluminada mostrando que las esporas, que se expusieron a altas dosis de iluminación láser monocromática no germinan y crecen hacia fuera, mientras que las esporas en regiones no iluminadas se recuperan completamente a las bacterias vegetativas expresando fluorescencia brillante de RecA-YFP (señal verde). (C, D) Las esporas cubrieron por partículas de contaminantes o múltiples capas de esporas (flechas) parece proteger esporas subyacentes de la inactivación por tratamiento de plasma y permiten que su germinación y consecuencia ("efecto sombra"). (C) las esporas eran tratados con plasma de 60 s e imagen 180 min después de la iniciación de la germinación o en (D) para 120 s y reflejada después de 240 min. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. microscopía electrónica (SEM)
- Utilizar microscopía electrónica para proporcionar información ultraestructural acerca de la morfología superficial de esporas de plasma tratado en comparación con controles no tratados. Capa de monocapas de esporas secas en cubreobjetos con oro-paladio (3 nm) mediante el uso de un recubridor sputter. Utilizar un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo para las muestras, operadas a 5 kV voltaje de aceleración entre un detector de electrónica de secundaria en el lente para revelar el contraste de la topografía de la proyección de imagen.
7. Análisis de datos
- Determinar la supervivencia de la espora del cociente N/N0, donde N es la media de UFC de las muestras tratadas y N0 es la media de UFC de controles no tratados de vacío. Trama de inactivación de esporas por el tratamiento de plasma de argón en función del tiempo (en segundos). Expresar todos los datos como medias y desviaciones estándar (n = 3).
- Analizar imágenes obtenidas por proyección de imagen de células vivas usando el software de imágenes. Cuantificar la proporción de germinación de la espora y rebasar después del tratamiento de plasma, recuento de esporas en representante de marcos al principio del experimento, así como después de 4 h. Para la determinación de la significación en los análisis de supervivencia de esporas, utilizar pruebas de ANOVA unidireccionales (análisis de varianza) con software estadístico). Valores de P < 0.05 se consideró como estadísticamente significativa.
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Representative Results
Supervivencia de los tratados con plasma B. subtilis esporas
Tratamiento del plasma de las esporas B. subtilis había utilizado en este estudio muestran una disminución en la supervivencia con aumento de la duración del tratamiento de plasma (figura 2). Las esporas de la cepa expresando la recA-gen fusionado a YFP mostraron curvas de supervivencia similares a las esporas de la cepa de tipo salvaje, lo que indica que la modificación genética no tiene ningún efecto significativo sobre la vitalidad bacteriana. Las esporas de la cepa de RecA-deficient exhiben una mayor sensibilidad hacia el tratamiento de plasma frente a las esporas de la cepa de tipo salvaje, demostrando que la presencia del gen RecA es reducir la pérdida de plasma-inducida de la vitalidad. Especialmente corto tratamiento de plasma de 15 s (P <0.003) y 30 s (P < 0,004) causa una disminución significativa de la vitalidad en cepas RecA-deficiente en comparación con el tipo salvaje y las cepas RecA-YFP. Después de 90 s de tratamiento del plasma, la vitalidad de todas las cepas se reduce en aproximadamente tres órdenes de magnitud.
Figura 2: Supervivencia de B. subtilis esporas de diferentes cepas después del tratamiento con plasma de baja presión de argón. Supervivencia (UFC media de plasma tratado media esporas UFC de esporas tratadas vacío; barras de error representan la desviación estándar) se enfrenta a la duración del tratamiento con plasma. PY79 (tipo salvaje; círculos cerrados), LAS72 (RecA-YFP; círculos grises) y LAS24 (ΔrecA; abrir círculos). Análisis estadísticos no mostraron diferencias significativas en la supervivencia de la espora entre PY79 (sin modificar RecA) y LAS72 (RecA-YFP-fusión).
Análisis ultraestructural de esporas tratadas con plasma por SEM
Para tener una idea de las repercusiones morfológicas del plasma tratamiento sobre las esporas, microscopía electrónica de barrido (SEM) se utilizó para analizar la morfología superficial de las esporas de plasma tratado en comparación con las esporas tratadas con vacío (control). La superficie externa de las esporas B. subtilis revelan características longitudinales ridge-como las estructuras que son constantemente accesibles en los tratados y no tratadas las esporas (figura 3). Tratamiento de plasma hasta 30 s no induce cambios significativos de la morfología superficial de la espora en comparación con el control (figura 3A-C). Aumento de la duración del tratamiento de plasma (60-240 s) conduce a una superficie más granular de la espora (figura 3D-F) y pequeñas grietas y fisuras se observan esporas tratadas para s 120 o 240. Por otra parte, pequeños glóbulos se presentan en las superficies de la espora (120 240 tratamientos de s, figura 3E, Fy s), que es causada por el material publicado de la capa, corteza o desde el interior de la base22. Estos glóbulos cubren de la espora todo y pueden encontrarse en las estructuras en forma de vena, así como en superficies intermedias.
Figura 3: SEM de esporas de B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) rociado sobre cubreobjetos de vidrio después del tratamiento de plasma de baja presión. Las esporas expuestas para solamente del vacío y no al plasma (control) se muestran en (A). (B-F) Esporas que fueron tratados con plasma con aumento de la duración (15, 30, 60, 120 y 240 s). Esporas que fueron tratados con plasma 60 s o ya aparecen más detalladas en su superficie de control de esporas o esporas que se plasma tratada de 15 y 30 s. grietas y fisuras (flechas blancas) son visibles en la superficie de las esporas tratados con plasma de 120 o 240 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Microscopía Celular de tratados con plasma B. subtilis en vivo esporas
Microscopía de células vivas de revivir las esporas de B. subtilis cepas expresan la proteína marcada con fluorescencia Reparación RecA (RecA-YFP) se realiza con el fin de analizar la capacidad de germinación y la expresión de RecA-YFP de esporas individuales en respuesta al tratamiento de plasma. Aquí, utilizamos tiempo resuelto microscopía de escaneo láser confocal para seguir germinación, extensión y progresión en estado vegetativo de esporas tratadas con plasma (figura 4) con respecto a problemas potencialmente conocidos por ejemplo sombreado efectos o la inhibición de germinación por altas dosis de iluminación monocromática láser (figura 1). Las esporas expuestas a sólo (control de vacío, figura 4A-c), presentan pocas señales fluorescentes durante los Estados tempranos del renacimiento de la espora (0 - 65 min, no se muestra). Se observa un aumento en la intensidad de la fluorescencia, probablemente debido a la acumulación de RecA-YFP, a ≥ 65 min cuando se forman las células vegetativas y primeras células empiezan a dividirse. Todas estas células albergan una señal de fluorescencia en al menos una posición dentro de cada célula. Casi todas las esporas (98 ± 2%; 589 ± 14, n = 4) tratada con vacío como un control de germinar y desarrollar una morfología de la célula en forma de varilla con una longitud uniforme de células individuales (figura 4B-C). En contraste con las esporas en los controles de vacío, las esporas trataron durante 15 s con plasma muestran una capacidad de germinación reducida de menos de 75 ± 4% (197 ± 8 esporas, números = 3, figura 4D-F), que indica que el tratamiento plasma induce daño en esporas latentes, que impide la germinación. Además, la morfología de rebasar las células es diferente de la morfología de las células en los controles. Las células crezca en las barras extensamente largas (más tiempo en comparación con el control) o siguen siendo pequeñas y pegar en la capa de la espora (figura 4G-I). Por otra parte, las células más alargadas lyse con el aumento de tamaño de célula (cabezas de flecha blanca, figura 4F). Señales de fluorescencia de RecA-YFP dentro de las células parecen ser ligeramente aumentado en comparación con las señales en las células control (figura 4C, F), pero no observaron diferencias significativas pueden ser (no se muestra). Esporas que plasma trataron por 30 s germinar hasta 25 ± 6% (± 4 99 esporas números = 3) y células vegetativas se retrasan notablemente en el crecimiento en comparación con el control de esporas y las esporas después de 15 s de tratamiento del plasma. Células vegetativas son más bien pequeñas y en forma pero varían en longitud (figura 4G-I). Sin embargo, pueden lisar las células de todos los tamaños durante tiempos más largos de incubación como para las muestras después de 15 s de tratamiento del plasma. Después de 60 s de tratamiento del plasma a menos de 2 ± 2% (8 ± 8 esporas, números = 3) las esporas son capaces de formar células vegetativas (J-Lde lafigura 4). Esporas que se plasma tratan de 90, 120 o 240 s puede ser analizada, pero muestran ninguna consecuencia o cualquier cambio en los niveles de fluorescencia de RecA-YFP (no mostrado).
Figura 4: Confocal láser análisis de microscopía de células de esporas B. subtilis en vivo partir de una cepa que RecA-YFP después de tratamiento del plasma y la iniciación de la germinación. Las esporas fueron seguidas en el tiempo (una imagen por 30 s) y se muestran imágenes de momentos 0, 2 y 4 h. (A-C) Esporas trataron con vacío solamente y no con plasma (control) germinan y crecen a las células vegetativas (B) y entran en fase de crecimiento exponencial (C). (D-L) Las esporas tratadas de diferente duración con el plasma de baja presión de argón muestran diferencias significativas en su extensión en comparación con las esporas del control (véase el texto para más detalles). Tratamiento (D-F) 15 (cabezas de flecha blancas representan las células vegetativas, que recientemente lisis), (G-I) 30 s tratamiento (cabezas de flecha negras visualizar células vegetativas, que eran pequeñas y pegan en la capa de la espora) y (J-L) 60 s después de tiempo de recuperación de esporas 0 h, 2 h y 4 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Esterilización de superficies con baja temperatura, baja presión de plasma es una alternativa prometedora distinta a los procedimientos de esterilización algo convencional como el tratamiento con radiaciones ionizantes radiación, productos químicos (por ejemplo, gases como el H2O2 o óxido de etileno) o calor seco y húmedo23. Métodos de esterilización normal sobre todo proporcionan una efectiva esterilización, pero se sabe que influyen en el material tratado y representan un riesgo potencial para el operador. Plasma de baja presión ofrece una inactivación biológica rápida y homogénea con la composición de varios componentes tales como fotones UV, electrones libres, iones y salido de átomos o moléculas (por ejemplo, ROS). Por lo tanto, la LPP puede aplicarse a materiales sensibles al calor y a la corrosión, como polímeros termoplásticos para implantes, instrumentos electrónicos o estructuras complejas de 3D. En el presente trabajo demostrar la aplicación de un sistema de prueba, en que monocapas de rociado B. subtilis esporas20 son tratados en un reactor de plasma de baja presión particular que fue descrito recientemente en detalle7. Examen microscópico de campo brillante de las esporas tratadas con plasma puede ser suficiente para obtener una estimación general de la eficacia de la esterilización. Sin embargo, estamos interesados en la orientación de los mecanismos subyacentes de plasma de baja presión y su influencia en la inactivación de esporas a nivel molecular. En combinación con la microscopía de fluorescencia de seguimiento que nos permite arrojar luz sobre los detalles de esta particular respuesta molecular de las esporas tratadas con plasma y potencialmente nos dan penetraciones en el mecanismo de inactivación fundamentales de plasma de baja presión.
Aquí, nos centramos en el análisis de la eficacia del tratamiento de plasma y efectos utilizando microscopía de células vivas, que permite después de esporas individuales después de la iniciación de la germinación. Notablemente, este enfoque particular revela un par de nuevos resultados que no se puede proporcionar mediante la medición de revitalización de la población de toda espora con determinación del número de células o UFC. En primer lugar, plasma-tratamiento de esporas no sólo afecta a la capacidad de extensión de forma dosis-dependiente, como era de esperar de la medición de la supervivencia por la determinación de unidades formadoras de colonias, sino también la morfología de las células vegetativas, que suelen desarrollar grandes barras para tabiques de forma según la división de célula apropiada junto con pequeñas células en la espora (15 s de tratamiento del plasma) o las células de una longitud reducida (30 s de tratamiento del plasma). Observaciones de las células con menor longitud no demostraron recuperación a la longitud normal de las células en momentos posteriores. Por otra parte, vivo revela que la mayoría de las células morfológicamente alteradas lyse en etapas posteriores de la observación de imágenes de la célula. Esto significa que daño adquirido por las esporas durante el tratamiento de plasma solo es eficaz en etapas posteriores de la revitalización de la espora, probablemente debido a daños en el ADN y que la maquinaria utilizada para la germinación y la consecuencia es más sólida hacia la esterilización de plasma que la maquinaria necesaria para el crecimiento vegetativo. Notable, expresión de la proteína de RecA-reparación de ADN parece ser bajo y casi ausente de las esporas y se desarrolla durante la fase vegetativa y consecuencia según lo indicado por un aumento en el RecA-YFP fluorescencia17. Sin embargo, incluso una expresión levemente creciente de RecA en esporas tratadas con plasma creciente, en comparación con esporas de control, no ayuda a rescatar la vitalidad de la célula cuantitativamente, porque mayoría de las células lyse o reventar después de consecuencia, sobre todo después de más de 3 horas de incubación. Este efecto se puede visualizar usando películas celular directo imágenes de lapso de tiempo de esporas germinadas. No podemos excluir que este efecto es exagerar por la condición de cultivo particular donde las células son forzadas en una monocapa con un fino recubrimiento de agar.
Otro resultado del análisis por microscopía de células vivas es que partículas contaminación (por ejemplo, partículas de polvo, esporas de otros) en la superficie de la capa monomolecular de esporas puede proteger las esporas subyacentes de los efectos dañinos del plasma. En tales casos incluso más tiempo de tratamiento del plasma parece ser ineficaz. Ya que estas contaminaciones son difíciles de evitar completamente, estrategias alternativas de tratamiento del plasma se deben probar, como el uso de la rotación planetaria durante el tratamiento de plasma junto con duración prolongada del tratamiento. El análisis por SEM indica que la capa de la espora es perforada con duración mayor de tratamiento de plasma que está en consonancia con la teoría de efectos plasma-mediada en materia22,24. Un tiempo de exposición prolongado (> 240 s) plasma puede incluso perforar las partículas contaminantes pueden dañar e inactivar las esporas subyacentes.
El protocolo presentado para microscopía de células vivas de la germinación de la espora y la consecuencia puede ser conveniente para otros estudios. Cubriendo las esporas con una capa delgada de agar fuerzas las esporas en un distinto plano óptico y restringe el movimiento lateral. Ambos efectos garantizan que las esporas y células creciente permanecen dentro del marco de imagen seleccionado. Enfoques similares se han descrito antes del25 pero ofrecen que menos flexibilidad que el método descrito aquí que permite elegir casi cualquier portador de muestras (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio, cubreobjetos o placa de Petri). En nuestras manos otras bacterias vegetativas podrían ser analizadas por microscopía de células vivas mediante el método de cubierta de agar). En cualquier caso, experimentos de control de cuidado debe realizar para evaluar posibles efectos de daño de la foto durante la proyección de imagen de células vivas, porque hemos observado que altas dosis de luz láser monocromática completamente inhiben la germinación de las esporas. Además de acortar el tiempo de la iluminación, es decir, incrementando los intervalos de observación, este fenómeno puede prevenirse reduciendo la intensidad del láser o abertura de la abertura confocal (pinhole).
En Resumen, entre las técnicas utilizadas para estudiar la eficacia del tratamiento del plasma en el modelo de rociado B. subtilis monocapas de esporas, células vivas microscopia ofrece perspectivas únicas en eventos celulares durante renacimiento de espora y ofrece la posibilidad de para analizar la dinámica de las proteínas marcadas por fluorescencia. Por otra parte, la preparación de la muestra particular, es decir, cubierta de las esporas con una capa delgada de agar, puede ser paradigmático para la proyección de imagen de otros microorganismos mediante microscopía de células vivas.
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Disclosures
No hay conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Andrea Schröder por su excelente asistencia técnica durante las partes de este trabajo y Nikea J. Ulrich por su ayuda durante la sesión de video. También nos gustaría agradecer a Lyle A. Simmons por su generosa donación de las cepas de Bacillus subtilis : LAS72 y LAS24. Este trabajo fue financiado en partes por las subvenciones de la Fundación de investigación alemana (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) a PA (AW, 7, 3-1) y RM (MO 2023/2-1) y el DLR conceden DLR-FuW-Projekt ISS vida, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (a F.M.F, M.R. y R.M.). F.M.F.2001 fue apoyado por una beca de doctorado de la escuela de investigación de Ciencias de la vida de espacio Helmholtz (SpaceLife) en el Centro Aeroespacial Alemán (DLR) en Colonia, Alemania, que fue financiado por la Asociación de Helmholtz (Helmholtz-Gemeinschaft) durante un período de seis años ( Grant no. VH-Ko-300) y recibió fondos adicionales de la DLR, incluyendo Comité Ejecutivo aeroespacial y el Instituto de medicina aeroespacial. Los resultados de este estudio se incluirán en la tesis doctoral de Felix M. Fuchs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
References
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