Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies

St&#233;phane Isabettini; Mirjam E. Baumgartner; Peter Fischer; Erich J. Windhab; Marianne Liebi; Simon Kuster

doi:10.3791/56812

JoVE Journal > Engineering

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Ingegneria

제작 절차 및 복굴절 측정 자석으로 응답 란타넘족 이온 킬레이트 화 인지질 어셈블리 설계에 대 한

Published: January 03, 2018

doi:

10.3791/56812

Stéphane Isabettini, Mirjam E. Baumgartner, Peter Fischer, Erich J. Windhab, Marianne Liebi, Simon Kuster

¹Laboratory of Food Process Engineering,ETH Zurich, ²MAX IV Laboratory,Lund University

Summary

자석으로 높은 반응 란타넘족 이온 킬레이트 화 polymolecular 어셈블리에 대 한 제작 절차 되 게 됩니다. 마그네틱 응답 nanopore 세포 막을 통해 밀어 남에 의해 맞게 어셈블리 크기에 의해 결정 됩니다. 어셈블리의 마그네틱 alignability 및 구조적인 변화 온도 유도 된 복굴절 측정, 핵 자기 공명 및 작은 각 중성자 뿌리기 무료 기법에 의해 감시 된다.

Abstract

Bicelles는 조정 디스크 같은 polymolecular 어셈블리 지질 혼합물의 큰 다양성에서 형성. 응용 프로그램 범위에서 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 막 단백질 구조 연구 nanotechnological 개발 광학 활성 및 자석으로 전환 젤의 형성을 포함 하 여. 이러한 기술 어셈블리 크기, 자석 응답 및 열저항의 높은 관리가 필요합니다. 1, 2의 혼합물-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)와 인지질 공액, 1, 2를 킬레이트 화는 란타넘족 이온 (Ln^{3 +})-dimyristoyl-sn-glycero-3-인-방법-신 triaminepentaacetate ( DMPE-DTPA), DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} 같은 높은 자석으로 응답 어셈블리에 조립 (어 금 니 비율 4:1:1) bicelles. 콜레스테롤 (철-오)과 독특한 physico-화학 특성을 제공 하는 어셈블리의 다른 세트에서 bilayer 결과에 스테로이드 파생 상품의 소개. 주어진된 지질 구성에 대 한 자석 alignability bicelle 크기에 비례 이다. Ln^{3 +} 의 complexation 크기 및 정렬 방향 측면에서 전례 없는 자석 응답에 있는 결과. 난방 시 소포에 디스크와 같은 구조의 온도 가역 붕괴 정의 된 기 공 크기와 멤브레인 필터를 통해 압출 하 여 어셈블리의 치수의 조정 수 있습니다. 자석으로 alignable bicelles 기 선구자에 의해 정의 하는 어셈블리 차원에서 발생 하는 5 ° C에 냉각 하 여 다시 생성 됩니다. 여기, 그리고 어셈블리의 자석 alignability 5.5 T 자기장에서 복굴절 측정 하 여 정량이 제작 절차 설명 했다. 인지질 bilayer에서 발생 한 복굴절 신호는 더는 bilayer에서 발생 하는 polymolecular 변경 모니터링 수 있습니다. 이 간단한 기술은 이다 bicelles 하 고용 일반적으로 NMR 실험을 보완.

Introduction

Bicelles는 수많은 지질 혼합물에서 얻은 디스크 모양의 polymolecular 어셈블리. ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ 그들은 널리 NMR 분광학에 의해 생체 막의 구조 특성에 대 한 사용 됩니다. ⁶ ^, ^{그러나 7} , 최근 노력 하고자 가능한 응용 프로그램의 필드를 확장 합니다. ⁵ ^, ⁸ ^, ⁹ 가장 공부 bicelle 시스템은 1, 2의 혼합물의 구성 되어-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 구성 어셈블리 및 1, 2의 평면 부분-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DHPC) 가장자리를 포함 하는 인지질. ¹ ^, ² ^, ³ 인지질 bilayer 지시 자체 조립된 polymolecular 구조의 건축 구성의 분자 기하학. ⁴ ^, ⁵ DMPE-DTPA와 교체 DHPC 높은 자석으로 대답 하 고 조정할 수 있는 bicelle 시스템을 생성합니다. ¹⁰ ^, ¹¹ DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (어 금 니 비율 4:1:1) bicelles 연관 많은 더 많은 상자성 란타넘족 이온 (Ln^{3 +}) 향상 된 자기 반응의 결과로 하는 bilayer의 표면에. ¹⁰ 또한, 교체 수용 DHPC 분자 DMPE-DTPA/Ln^{3 +} 수 희석 방지 bicelles의 형성 ¹¹

평면 polymolecular 어셈블리의 자석 alignability는 그들의 전반적인 자기 에너지에 의해 결정

(1)

B는 자기 필드 강도 자석 상수, n 집계 수와 는 bilayer를 구성 하는 지질 분자 diamagnetic 자화 율 이방성. 따라서, 자기장에 DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles의 응답은 그들의 크기 (집계 숫자 n)와 분자 diamagnetic 자화 율 이방성 Δχ에 의해 지어진 다. 후자는 쉽게 달성 chelated Ln^{3 +}의 특성을 변경 하 여. ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ 소개 콜레스테롤 (철-오) 또는 다른 스테로이드 유도체는 bilayer에 집계 숫자 n와 어셈블리의 자기 자화 율 Δχ 튜닝의 가능성을 제공 합니다. ¹¹ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ 주어진된 지질 구성에 대 한 큰 어셈블리 포함 더 많은 지질 E_{탄 창} (큰 집계 숫자 n)에 기여 가능 결과 더 alignable 종에. DMPC/DHPC bicelles의 크기 예를 들면, 전통적으로 구성 지질 비율이 나 총 농도의 최적화를 통해 제어 됩니다. ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² 이 DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles에, 있지만 난방 제공 시 소포를 bicelle에서 그들의 열 가역 변환을 짓는 옵션 추가. 기계와 같은 멤브레인 필터를 통해 압출 수는 vesicles의 형성을 의미 합니다. 자석으로 alignable bicelles는 5 ° C에 냉각 시 재생성 하 고 그들의 크기 기 선구자에서 결정 됩니다. ¹¹ 여기, 우리가에 초점을 가진 DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} 기계 제조 절차의 잠재력 (어 금 니 비율 4:1:1) 또는 DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 16:4:5:5) 참조 시스템으로. 프로세스 작업 다른 Ln^{3 +} 보다 Tm^{3 +}비슷하게 작동 합니다. 이러한 기술에서 제공 하는 가능성의 넓은 범위는 그림 1 에서 강조 표시 하 고 광범위 하 게 다른 논의. ²³

그림 1: 가능한 제작 절차의 개요 개요. 공부 자석으로 alignable Ln^{3 +} chelating polymolecular 어셈블리는 구성 중 DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 4:1:1) 또는 DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 16:4:5:5). 건조 지질 영화 7.4의 pH 값에 50 m m 인산 염 버퍼 화 이며 총 지질 농도 15 m m. 지질 영화의 효과적인 수 분 요구도 녹고 사이클 (피트) 또는 열 및 냉각 사이클을 동결 (H & C). H & C 사이클 마지막 동결 단계, 녹고 후 샘플을 다시 생성 하거나 압출 추가 없이 사용할 수 있다면 그들은 시간의 연장된 기간 동안 냉동 보관 하는 샘플을 다시 생성에 필요 하다. 이 단계는 Isabettini 외에 의해 광범위 하 게 논의 된다. ²³ 극대 alignable polymolecular 어셈블리 지질 구성에 따라 서로 다른 어셈블리 아키텍처를 제공 하는, 달성 된다. Bicelle 크기와 자석 alignability nanopore 멤브레인 필터를 통해 압출 (Ext)에 의해 가변 이다. 제시 정렬 요소 A_f 800, 400, 200, 또는 100 통해 압출 DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 16:4:5:5) 샘플의 2D 작은 각 중성자 산란 (SANS) 패턴에서 계산 된 숨 구멍 nm. 측정 없이 더 자세히 여기에 적용 되지 것입니다 bicelle 정렬 측정의 보완 수단입니다. ¹¹ ^, ¹⁶ 는 A_f 등방성 산란에 대 한 0-1 (병렬 중성자 산란 또는 자기장 방향 bicelles의 수직 정렬)에서 배열 한다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Bicelles의 구조는 다양 한 특성화 기법에 의해 광범위 하 게 연구 되었습니다. ¹³ 자기 필드에 노출 하는 bicelles의 맞춤 NMR 분광학 또는 작은 각 중성자 산란 (SANS) 실험을 사용 하 여 측정할 되었습니다. ⁵ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁴ ^, ^{그러나 25} , 변화와 존재 Ln^{3 +} 발생 NMR 봉우리의 확대는 메서드에 심각한 한계. ¹⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ 있지만 SAN 실험이이 제한, 대체에서 고통을 하지 않습니다 그리고 더 접근 기술 솔루션에서 어셈블리의 자석으로 유도 맞춤의 일상적인 정량화에 대 한 바람직한. 복굴절 측정 실용적이 고 비교적 간단한 대안입니다. 비슷하게 NMR 실험, 복굴절 측정 지질 재배열 및 지질 단계는 bilayer에 발생에 대 한 귀중 한 정보를 공개. 또한, 온도 같은 환경 조건 변경 polymolecular 어셈블리에서 발생 하는 기하학적 변환 모니터링 된다. ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ 자기 유도 복굴절 Δn′ 인지질 시스템의 다양 한 유형을 공부에 사용 되었습니다. ¹³ ^, ²⁹ ^, ³⁰ 는 자기장에서 위상 변조 기술에 따라 복굴절 측정 bicelles의 방향을 감지 하는 가능한 방법입니다. ¹² ^, ¹⁶ ^, ¹⁸ ^, ²⁹ ^, ³¹ ^, ³² 35 T까지 높은 자기장에서 복굴절와 함께 bicelles를 조사 하는의 가능성 또한 M. Liebi 그 외 여러분 에 의해 입증 되었다 ¹³

편광 이방성 물자 들어가면 일반 및 특별 한 파에서 굴절 됩니다. ¹¹ 두 파 다른 속도 있고 지체 δ에 의해 단계에서 이동 된다. 지체 δ의 정도 측정 하 고 복굴절 신호로 변환 는 소재를 사용 하 여 이방성의 정도 계량 하기

(2)

여기서 λ는 레이저와 d의 파장은 샘플의 두께입니다. 인지질은 광학 이방성 그리고 탄화수소 꼬리에 평행 하 게 그들의 긴 분자 축과 일치 하는 그들의 광 축. ¹¹ ^, ¹² 는 인지질은 임의로 솔루션에서 지향 하는 경우 지체 없이 측정 됩니다. 지체는 인지질 서로 평행 정렬 됩니다 때 측정 된다. 자석으로 유도 복굴절 ; 자기장에서 분자의 방향에 따라 양수 또는 음수 부호를 가질 수 있습니다 그림 2를 참조 하십시오. X 축에 평행 정렬 인지질 네거티브 귀 착될 것 이다 z 축을 따라 정렬 된 결과 긍정적인 그러나, . 아니 복굴절 때 광 축과 일치 빛 전파의 방향으로는 인지질 y 축에 평행 하 게 정렬 관찰 됩니다.

그림 2: 맞춤 인지질 및 자기 유도 복굴절의 해당 표시의 . 측정된의 는 자기장에서 인지질의 방향에 따라 달라 집니다. 파선 분자의 광 축을 나타냅니다. 빛은 45 °에서 편광 하 고 y 방향으로 전파. 자기장 B z 방향에서입니다. 이 그림은 M. Liebi에서 수정 되었습니다. ¹¹ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Bicelles의 등방성 콜 로이드 정지, 경우는 bilayer에 인지질의 배열에 의해 유도 된 방향 지체 δ 비우기 손실 될 것입니다. Bicelles는 또한 편광된 빛의 지체 δ를 일으키는 그들의 bilayers에 광학 활성 인지질을 찾으시는 순서 정렬 해야 합니다. 따라서, 복굴절 polymolecular 어셈블리의 자석 alignability 계량 하는 중요 한 도구입니다. Bicelles 정렬 자기장에 수직 긍정적인 보장할 병렬 정렬 그 부정적인 항복 것입니다 하는 동안, . 서명 설정의 정렬에 따라 달라 집니다 그리고 참조 샘플을 확인할 수 있습니다.

Protocol

1. DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + 제작 절차 (어 금 니 비율 4:1:1) 및 어셈블리 DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm3 + (어 금 니 비율 16:4:5:5) polymolecular 사전 준비 에탄올으로 워시 홍 조에 의해 모든 유리 한번는 클로 프롬을 안정화 (> 99% 클로 프롬) 압축 공기 건조. 2 가지 10 mg/mL 재고 솔루션 DMPC와 DMPE-DTPA의 에탄올 안정 클로 프롬에 생산 (> 99% 클로 프롬), 에탄올 안정 클로 프롬에 철 …

Representative Results

압출 비 DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + 의 복굴절 신호 (어 금 니 비율 4:1:1) 샘플 난방 및 냉각 주기 5에서 ~ 40 ° C 및 1 ° C/min (그림 6)의 속도로 다시 동안 5.5 T 자기장에서 모니터링 했습니다. 복굴절 결과 1.5 x 10-5, 배나 강한 보고 압출 시스템의 값이 있는 5 ° C에서 높은 자기 정렬 확인. 6 , 7 , <sup …

Discussion

복굴절 측정 했다 SAN과 함께에서 사용 하는 방법의 세부 계정을 생성 높은 자석으로 응답 Ln^{3 +}어셈블리 Isabettini 외 에 인지질 킬레이트 화 하기 위한 방법을 평가 하 실험 ²³ 제안 된 제조 프로토콜은 또한 더 긴 DPPC와 DPPE DTPA 인지질으로 구성 하는 어셈블리에 대 한 또는 그들의 bilayer에 화학적 조작된 스테로이드 유도체를 포함에 대 한 적용 됩니다. ^1…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 회계 SMhardBi (프로젝트 번호 200021_150088/1)를 위한 스위스 국립 과학 재단을 인정 합니다. SANS 실험은 스위스 spallation 중성자 소스 SINQ, 폴 Scherrer Instute, Villigen, 스위스에서 수행 했다. 따뜻하게 저자 박사 요 아 킴 Kohlbrecher SAN 실험과 함께 그의 지도 감사합니다. 높은 자기장에서 복굴절 측정 설치 높은 분야 자석 실험실 HFML, Nijmegen, 네덜란드에서 기존 설치에서 영감을 했다. 우리는 브루노 Pfister 복굴절 설치의 전자 제품 개발에 그의 도움에 대 한, 1 월 Corsano와 다니엘 Kiechl, 레이저의 정밀 하 고 손쉬운 맞춤을 허용 하는 프레임 워크를 구축 및 지속적인 기술 지원에 대 한 박사 베른하르트 콜 러 감사 합니다.

Materials

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Thulium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439649	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Dysprosium(III) chloride	Sigma-Aldrich	325546	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Ytterbium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439614	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Chloroform	Sigma-Aldrich	319988	contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	≥99.9%
Cholesterol	Amresco	433	Ultra pure grade
D2O	ARMAR chemicals	1410	99.8 atom % D
Ultrapure water	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
electronic pH meter	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter	VWR	515-2032
Whatmann Filter paper	VWR	230600
25 ml round bottom flask	VWR	201-1352	14/23 NS
3 ml glass snap-cup	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
2.5 ml glass syringe	Hamilton
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Merk	1.06342	Salt used to make phosphate buffer
di-Sodium hydrogen phosphate	Merk	1.06586	Salt used to make phosphate buffer
Liquid Nitrogen	Carbagas	–
Pressurized Nitrogen gas	Carbagas	–	200 bar bottle
Lipid Extruder 10 ml	Lipex	–	Fully equipped with thermobarrel
High-pressure PVC tube	GR NETUM	–	must resist more than 4 MPa
Serto adaptors	Sertot	–
Nitrile gloves	VWR	–
2 ml glass pipettes	VWR	612-1702	230 mm long
Diode Laser	Newport	LPM635-25C
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier	SRS	SR830
Photodiode Detector	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silicon, photo-conductive
5.5 T Cryogenic Magnetic	Cryogenic/Oerlikon AG	–	12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
Second order low pass filter	home-built	–	Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Photoelastic modulator	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Calcite Polarizer	Newport	10GT04	25.4mm diameter
Quartz sample cuvette	Hellma	165-10-40	temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
Temperature probe	Thermocontrol	–	Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
Non-polarizing mirrors	Newport	50326-1002	25.4mm
RS 232 cables	National Instruments	189284-02	For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
BNC 50 Ω cable and connectors	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National Instruments	–
Industrial power supply	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Waterbath	Julabo	FP40-HE	refrigerated/Heating Circulator

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