Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies

St&#233;phane Isabettini; Mirjam E. Baumgartner; Peter Fischer; Erich J. Windhab; Marianne Liebi; Simon Kuster

doi:10.3791/56812

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Ingegneria

Procedimientos de fabricación y medidas de birrefringencia para diseñar Ion lantánido magnéticamente sensibles quelantes ensamblajes de fosfolípidos

Published: January 03, 2018

doi:

10.3791/56812

Stéphane Isabettini, Mirjam E. Baumgartner, Peter Fischer, Erich J. Windhab, Marianne Liebi, Simon Kuster

¹Laboratory of Food Process Engineering,ETH Zurich, ²MAX IV Laboratory,Lund University

Summary

Se presentan procedimientos de fabricación para el ion lantánido altamente magnéticamente sensibles quelantes conjuntos polimoleculares. La respuesta magnética se basa en el tamaño de la Asamblea, que se adapta por extrusión a través de membranas nanopore. Las Asambleas alignability magnética y los cambios estructurales inducidos por la temperatura son monitoreados por las mediciones de birrefringencia, una técnica gratuito para resonancia magnética nuclear y dispersión de neutrones de ángulo pequeño.

Abstract

Bicelles son conjuntos polimoleculares de disco ajustables formados de una gran variedad de mezclas de lípidos. Las aplicaciones van desde estudios estructurales de proteínas de membrana por resonancia magnética nuclear (RMN) a desarrollos nanotecnológicos incluyendo la formación de geles ópticamente activos y magnéticamente conmutables. Estas tecnologías requieren un control alto del tamaño de la Asamblea, respuesta magnética y resistencia térmica. Mezclas de 1, 2-dimyristoyl –sn– glycero-3-fosfocolina (DMPC) y sus iones lantánidos (Ln^{3 +}) quelante conjugado de fosfolípidos, 1, 2-dimyristoyl –sn– glycero-3-fosfo-etanolamina-dietilenglicol triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), montar en conjuntos altamente magnéticamente sensibles tales como DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) bicelles. Introducción de colesterol (Chol-OH) y derivados esteroides en la bicapa resulta en otro conjunto de ensamblados que ofrece propiedades fisico-químicas únicas. Para una composición de lípidos determinado, la alignability magnética es proporcional al tamaño del bicelle. La complejación de Ln^{3 +} resulta en respuestas magnéticas sin precedentes en términos de magnitud y alineación de dirección. El colapso de la termo-reversible del disco-como las estructuras en vesículas al calentarse permite adaptación de dimensiones de las asambleas por extrusión a través de filtros de membrana con tamaño de poro definido. Las bicelles magnética alignable se regeneran por refrigeración a 5 ° C, resultando en conjunto las dimensiones definidas por los precursores de la vesícula. En este documento, se explica este procedimiento de fabricación y el alignability magnético de las Asambleas se cuantifica por mediciones de birrefringencia bajo un campo de magnético 5.5 T. La señal de la birrefringencia, procedente de la bicapa de fosfolípidos, además permite la monitorización de polimoleculares cambios que ocurren en la bicapa. Esta técnica simple es complementaria a los experimentos de NMR que comúnmente se emplean para caracterizar bicelles.

Introduction

Bicelles son conjuntos polimoleculares de disco como de numerosas mezclas de lípidos. ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ son ampliamente utilizados para la caracterización estructural de biomoléculas de membrana por espectroscopia de RMN. ⁶ ^, ⁷ sin embargo, los esfuerzos recientes tienen por objeto ampliar el campo de posibles aplicaciones. ⁵ ^, ⁸ ^, ⁹ el sistema de bicelle más estudiado se compone de una mezcla de 1, 2-dimyristoyl –sn– glycero-3-fosfocolina (DMPC), constituyendo la parte plana de la Asamblea y 1, 2-dihexanoyl –sn– glycero-3-fosfocolina (DHPC) fosfolípido que cubre el borde. ¹ ^, ² ^, ³ la geometría molecular de las composición de la bicapa de fosfolípidos determinan la arquitectura de la estructura de uno mismo-montado polimoleculares. ⁴ ^, ⁵ reemplazo de DHPC con DTPA DMPE genera sistemas de bicelle altamente magnético sensible y armonioso. ¹⁰ ^, ¹¹ DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) bicelles asociado con muchos más iones lantánidos paramagnéticos (Ln^{3 +}) en la superficie de la bicapa, resultando en una mayor respuesta magnética. ¹⁰ por otra parte, reemplazando las moléculas solubles en agua de DHPC con^{3 +} permite DMPE-DTPA/Ln la formación de bicelles resistente a la dilución. ¹¹

Su energía magnética en general, obedece a la alignability magnética de conjuntos polimoleculares planar

(1)

donde B es la fuerza del campo magnético, el magnético n constante, el número de agregación y la anisotropía de susceptibilidad diamagnético molecular de las composición de la bicapa de lípidos. Por lo tanto, la respuesta de DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles a los campos magnéticos se adapta por su tamaño (número n total) y el Δχ de anisotropía de susceptibilidad diamagnético molecular. Este último se obtiene fácilmente cambiando la naturaleza de los quelatos Ln^{3 +}. ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ introducción colesterol (Chol-OH) u otros derivados esteroides en la bicapa ofrece la posibilidad de templar el agregado número n y la Δχ de la susceptibilidad magnética de las Asambleas. ¹¹ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ para una composición de lípidos determinado, asambleas más grandes contienen más lípidos capaces de contribuir a la E_mag (n número total más grande), dando lugar a especies más alignable. Por ejemplo, el tamaño de bicelles DMPC/DHPC, convencionalmente se controla a través de la optimización de la concentración de lípidos en relación o total composición. ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² aunque esto es posible en DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles, su transformación termo-reversible de bicelle vesículas sobre la calefacción ofrece había añadido opciones de adaptación. Mecánica: por ejemplo la extrusión a través de filtros de membrana permite la formación de las vesículas. Las bicelles magnética alignable se regeneran en refrigeración a 5 ° C y sus dimensiones son dictadas a partir de los precursores de la vesícula. ¹¹ adjunto, nos centramos en el potencial de los procedimientos de fabricación mecánica con DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5) como sistemas de referencia. El proceso funciona de manera análoga cuando se trabaja con otros Ln^{3 +} que Tm^{3 +}. La amplia gama de posibilidades que ofrecen estas técnicas se destaca en la figura 1 y ampliamente discutido en otros lugares. ²³

Figura 1: Descripción esquemática de los procedimientos de fabricación posible. Las estudiadas magnéticamente alignable Ln^{3 +} quelantes polimoleculares asambleas están compuestas de cualquier DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5). La película lipídica seca se hidrata con un 50 mM de tampón fosfato a un pH de 7.4 y la concentración total de lípidos es 15 mM. Una hidratación eficaz de la película de lípidos requiere ya sea congelación descongelación ciclos (FT), o calefacción y ciclos de refrigeración (H & C). H & C ciclos son necesarios para la regeneración de las muestras después de la última helada descongelación paso o regenerar muestras mantuvo congeladas durante un período prolongado de tiempo si han de usarse sin más la protuberancia. Estos pasos se discuten extensivamente por Isabettini et al. Se consiguen ²³ polimoleculares máximo alignable asambleas, ofrecer arquitecturas ensamblado diferente basadas en la composición de lípido. El tamaño de la bicelle y la alignability magnética es sintonizable por extrusión (Ext) a través de filtros de membrana nanopore. La alineación presentada factores A_f se computaron a partir de patrones de dispersión (SANS) 2D ángulo pequeño neutrón de una DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5) muestra que se saca a través de 800, 400, 200 o 100 nm poros. SANS las mediciones son un medio complementario de cuantificación de la alineación de bicelle que no se tratarán más detalladamente en este documento. ¹¹ ^, ¹⁶ el_f oscila entre -1 (dispersión de neutrones paralelo o alineación perpendicular de la bicelles con respecto a la dirección del campo magnético) a 0 para dispersión isotrópica.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La estructura del bicelles ha sido extensamente estudiada por una amplia gama de técnicas de caracterización. ¹³ la alineación de bicelles expuestas a un campo magnético se ha cuantificado mediante espectroscopia RMN o ángulo pequeño neutrón dispersión (SANS) de experimentos. ⁵ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁴ ^, ²⁵ sin embargo, el cambio y ensanchamiento de los picos de NMR que ocurre en presencia de Ln^{3 +} son serias limitaciones al método. ¹⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ aunque SANS experimentos no sufren de esta limitación, alternativa y técnicas más accesibles son deseables para la cuantificación rutinaria de alineación magnéticamente inducida de asambleas en la solución. Medidas de birrefringencia son una alternativa viable y relativamente simple. Análogamente a los experimentos de NMR, mediciones de birrefringencia revelan información valiosa sobre los cambios de lípidos y lípidos fases que ocurren en la bicapa. Por otra parte, transformaciones geométricas que se producen en el conjunto polimoleculares con cambio de condiciones ambientales como la temperatura se controlan. ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ Δn′ de birrefringencia inducida magnéticamente se ha utilizado para estudiar varios tipos de sistemas de fosfolípido. ¹³ ^, ²⁹ ^, ³⁰ medidas de birrefringencia basadas en la técnica de modulación de fase en un campo magnético es un método viable para detectar orientación de bicelles. ¹² ^, ¹⁶ ^, ¹⁸ ^, ²⁹ ^, ³¹ ^, ³² la posibilidad de investigar bicelles con birrefringencia en altos campos magnéticos de hasta 35 T también fue demostrada por M. Liebi et al. ¹³

Cuando la luz polarizada entre un material anisotrópico, se refracta en una onda ordinaria y extraordinaria. ¹¹ las dos ondas tienen diferentes velocidades y se cambia de puesto en fase por una δ de retraso. El grado de retardo δ es medido y convertido en una señal de birrefringencia para cuantificar el grado de anisotropía en el material

(2)

donde λ es la longitud de onda del láser y d es el espesor de la muestra. Los fosfolípidos son ópticamente anisotropic y su eje óptico coincide con sus ejes moleculares largo, paralelos a la cola de hidrocarburo. ¹¹ ^, ¹² ningún retraso se mide si los fosfolípidos están orientados aleatoriamente en solución. Retraso se mide cuando los fosfolípidos están alineados paralelos uno al otro. La birrefringencia inducida magnéticamente puede tener un signo positivo o negativo dependiendo de la orientación de las moléculas en el campo magnético; Vea la figura 2. Los fosfolípidos alineados paralelos al eje x dará como resultado un negativo , mientras que ésos alineados a lo largo del eje z como resultado positivo . Birrefringencia no se observa cuando el eje óptico coincide con la dirección de propagación de la luz como el fosfolípido alinea paralelo al eje y.

Figura 2: Alineación de los fosfolípidos y el signo correspondiente de la birrefringencia inducida magnéticamente . El signo de la medida depende de la orientación de los fosfolípidos en el campo magnético. Las líneas punteadas indican el eje óptico de la molécula. La luz está polarizada a 45° y se propaga en la dirección y. El campo magnético B es en la dirección z. Esta figura ha sido modificada de M. Liebi. ¹¹ haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el caso de una suspensión coloidal isotrópica de bicelles, la orientación inducida por el arreglo de los fosfolípidos en la bicapa se perderá, poner a cero el δ de retraso. La bicelles también debe quedar alineada con el fin de orientar los fosfolípidos ópticamente activos en sus bicapas, causando una retraso δ de la luz polarizada. En consecuencia, la birrefringencia es una herramienta sensible para cuantificar la alignability magnética de conjuntos polimoleculares. Bicelles alineado perpendicularmente al campo magnético producirá un positivo , mientras que ésos alineados paralelos dará una negativa . El signo depende de la alineación de la instalación y se puede verificar con una muestra de referencia.

Protocol

1. procedimiento fabricación de DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) y DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (fracción molar 16:4:5:5) conjuntos polimoleculares Preparaciones preliminares Lave toda la cristalería por lavado una vez con etanol estabilizado cloroformo (> 99% cloroformo) y seque con aire comprimido. Producir 2 distintas 10 mg/mL soluciones de DMPC y DMPE-DTPA en cloroformo estabilizado con etanol (> cloroformo 99%), una solución stock de…

Representative Results

La señal de la birrefringencia de una no sacó DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) muestra fue supervisada en un campo de magnético 5.5 T durante un calentamiento y enfriamiento ciclo de 5 a 40 ° C y a una velocidad de 1 ° C/min (figura 6). Los resultados de birrefringencia confirman alineaciones magnéticas alta a 5 ° C con un valor de 1.5 x 10-5, dos veces tan fuerte en cuanto a los sistemas de extrusión divulgados….

Discussion

Un relato detallado de cómo las mediciones de la birrefringencia se usaron en combinación con SANS experimentos para evaluar los métodos de generación altamente magnéticamente sensibles Ln^{3 +}quelantes fosfolípidos asambleas es de Isabettini et al. ²³ los protocolos de fabricación propuesto también son aplicables para asambleas compuestas de los fosfolípidos más de DPPC y DPPE-DTPA o para aquellos que contienen derivados esteroides químicamente modificados en su bica…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen la Swiss National Science Foundation para la financiación de SMhardBi (proyecto número 200021_150088/1). Se realizaron los experimentos SANS en la fuente de neutrón del spallation suizo SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Suiza. Los autores agradecen con gusto el Dr. Joachim Kohlbrecher para su dirección con los experimentos SANS. La configuración de medida de birrefringencia bajo campos magnéticos altos se inspiró de la configuración existente en el laboratorio magnético de alto campo HFML, Nijmegen, Países Bajos. Agradecemos a Bruno Pfister por su ayuda en el desarrollo de la electrónica de la configuración de la birrefringencia, Jan Corsano y Daniel Kiechl para la construcción de los marcos que fina y fácil alineación del láser y Dr. Bernhard Koller para apoyo técnico continuo.

Materials

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Thulium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439649	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Dysprosium(III) chloride	Sigma-Aldrich	325546	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Ytterbium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439614	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Chloroform	Sigma-Aldrich	319988	contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	≥99.9%
Cholesterol	Amresco	433	Ultra pure grade
D2O	ARMAR chemicals	1410	99.8 atom % D
Ultrapure water	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
electronic pH meter	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter	VWR	515-2032
Whatmann Filter paper	VWR	230600
25 ml round bottom flask	VWR	201-1352	14/23 NS
3 ml glass snap-cup	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
2.5 ml glass syringe	Hamilton
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Merk	1.06342	Salt used to make phosphate buffer
di-Sodium hydrogen phosphate	Merk	1.06586	Salt used to make phosphate buffer
Liquid Nitrogen	Carbagas	–
Pressurized Nitrogen gas	Carbagas	–	200 bar bottle
Lipid Extruder 10 ml	Lipex	–	Fully equipped with thermobarrel
High-pressure PVC tube	GR NETUM	–	must resist more than 4 MPa
Serto adaptors	Sertot	–
Nitrile gloves	VWR	–
2 ml glass pipettes	VWR	612-1702	230 mm long
Diode Laser	Newport	LPM635-25C
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier	SRS	SR830
Photodiode Detector	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silicon, photo-conductive
5.5 T Cryogenic Magnetic	Cryogenic/Oerlikon AG	–	12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
Second order low pass filter	home-built	–	Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Photoelastic modulator	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Calcite Polarizer	Newport	10GT04	25.4mm diameter
Quartz sample cuvette	Hellma	165-10-40	temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
Temperature probe	Thermocontrol	–	Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
Non-polarizing mirrors	Newport	50326-1002	25.4mm
RS 232 cables	National Instruments	189284-02	For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
BNC 50 Ω cable and connectors	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National Instruments	–
Industrial power supply	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Waterbath	Julabo	FP40-HE	refrigerated/Heating Circulator

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Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).