Fabrikasjon prosedyrer og Birefringence mål for utforme magnetisk forståelsesfull transisjonsmetall Ion chelaterande Phospholipid samlinger

Summary

Fabrikasjon prosedyrer for svært magnetisk forståelsesfull transisjonsmetall ion chelaterande polymolecular samlinger presenteres. Magnetisk svaret er diktert av montering størrelsen, som er skreddersydd ved ekstrudering gjennom nanopore membraner. Samlingene magnetiske alignability og temperatur-indusert strukturelle endringer overvåkes av birefringence mål, en gratis teknikk kjernefysiske magnetisk resonans og liten vinkel neutron spredning.

Abstract

Bicelles er tunable diskett-like polymolecular samlinger fra et stort utvalg av lipid blandinger. Programmer spenner fra membranen protein strukturelle studier av kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) nanoVT utviklingen inkludert dannelsen av optisk aktiv og magnetisk valgbar gels. Slike teknologier krever høy kontroll montering størrelse, magnetiske svar og termisk motstand. Blandinger av 1,2-dimyristoyl –sn– glycero-3-phosphocholine (DMPC) og transisjonsmetall ion (Ln^{3 +}) chelaterande phospholipid konjugert, 1,2-dimyristoyl –sn– glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), samle inn svært magnetisk forståelsesfull samlinger som DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (molar forholdet 4:1:1) bicelles. Innføring av kolesterol (Chol-OH) og steroid derivater i bilayer fører til et annet sett med samlinger tilbyr unike fysikalsk-kjemiske egenskaper. For en gitt lipid komposisjon er den magnetiske alignability proporsjonal med størrelsen bicelle. Complexation av Ln^{3 +} gir enestående magnetiske svar i både størrelse og justering retning. Thermo-reversibel sammenbruddet av disk-lignende strukturer i blemmer på oppvarming kan skreddersy samlingene dimensjoner ved ekstrudering gjennom membran filtre med definerte pore størrelser. Magnetisk alignable bicelles genereres av kjøling til 5 ° C, noe som resulterer i montering dimensjoner definert av vesicle forløpere. Her, denne fabrikasjon prosedyren er forklart og den magnetiske alignability for samlingene er kvantifisert ved birefringence målene under et 5,5 T magnetfelt. Birefringence signalet, som stammer fra phospholipid bilayer, kan ytterligere overvåking av polymolecular omveltningene i bilayer. Denne enkle teknikken er komplementære til NMR eksperimenter som brukes ofte til å beskrive bicelles.

Introduction

Bicelles er diskett-like polymolecular samlinger fra mange lipid blandinger. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} de er mye brukt for den strukturelle karakteristikken av membran biomolecules av NMR spektroskopi. ^{6 , 7} men siste innsats sikte på å utvide området mulige anvendelser. ^{5 , 8 , 9} mest studerte bicelle systemet består av en blanding av 1,2-dimyristoyl –sn– glycero-3-phosphocholine (DMPC), utgjør de planar del av forsamlingen, og 1,2-dihexanoyl –sn– glycero-3-phosphocholine (DHPC) phospholipid dekker kanten. ^{1 , 2 , 3} molekylær geometri fosfolipider komponere bilayer diktere arkitektur selv montert polymolecular strukturen. ^{4 , 5} erstattet DHPC med DMPE-DTPA genererer svært magnetisk responsive og tunable bicelle systemer. ^{10 , 11} DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (molar forholdet 4:1:1) bicelles forbinder med mange flere spinn transisjonsmetall ioner (Ln^{3 +}) på det bilayer overflaten, resulterer i en utvidet magnetiske respons. ¹⁰ videre erstatte vannløselige DHPC molekyler med DMPE-DTPA/Ln^{3 +} gjør dannelsen av fortynning-resistente bicelles. ¹¹

Den magnetiske alignability av Plane polymolecular samlinger er diktert av sin samlede Magnetisk energi,

(1)

hvor B er magnetisk feltstyrke, magnetisk konstant, n hvor aggregering og molekylært diamagnetic mottakelighet anisotropy av lipider komponere bilayer. Derfor er svaret av DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles magnetfelt skreddersydd etter deres størrelse (samlet antall n) og molekylær diamagnetic mottakelighet anisotropy Δχ. Sistnevnte er lett oppnådd ved å endre innholdet av sin natur chelated Ln^{3 +}. ^{12 , 13 , 14 , 15} presenterer kolesterol (Chol-OH) eller andre steroid derivater i bilayer tilbyr muligheten for tuning både samlet mange n og magnetiske mottakelighet Δχ av samlingene. ^{11 , 16 , 17 , 18 , 19} for en gitt lipid komposisjon, større samlinger inneholder flere lipider i stand til å bidra til E_mag (større samlede nummer n), som resulterer i mer alignable arter. Størrelsen på DMPC/DHPC bicelles, for eksempel kontrollert konvensjonelt gjennom optimalisering av komponist lipid forholdet eller totale konsentrasjonen. ^{20 , 21 , 22} selv om dette er mulig i DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles, deres thermo-reversibel transformasjon fra bicelle til blemmer på oppvarming tilbyr lagt skreddersøm alternativer. Mekanisk betyr som ekstrudering gjennom membran filtre kan forme av blemmer. Magnetisk alignable bicelles genereres på kjøling til 5 ° C og deres dimensjoner er diktert fra vesicle forløpere. ¹¹ Herein, vi fokus på potensialet til mekaniske fabrikasjon prosedyrer med DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molar forholdet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molar forholdet 16:4:5:5) som referanse systemer. Prosessen fungerer analogt når du arbeider med andre Ln^{3 +} enn Tm^{3 +}. Det brede spekter av muligheter som tilbys av disse teknikkene er uthevet i figur 1 og mye diskutert andre steder. ²³

Figur 1: skjematisk oversikt over mulig fabrikasjon prosedyrene. Studert magnetisk alignable Ln^{3 +} chelaterande polymolecular samlingene er sammensatt av en DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molar forholdet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molar forholdet 16:4:5:5). Tørr lipid filmen er hydratiserte med en 50 mM fosfatbuffer på en pH-verdi på 7,4 totale lipid konsentrasjonen er 15 mM. En effektiv hydrering av lipid filmen krever enten fryse tiner sykluser (FT) eller oppvarming og kjøling sykluser (H & C). H & C sykluser er nødvendig å regenerere prøver etter siste fryse tining trinn, eller å regenerere prøver holdt frosne over en lengre periode hvis de brukes uten ytterligere ekstrudering. Disse trinnene er mye diskutert av Isabettini et al. ²³ maksimalt alignable polymolecular samlinger er oppnådd, levere annen samling arkitekturer basert på lipid sammensetningen. Bicelle størrelse og magnetiske alignability er tunable ved ekstrudering (Ext) gjennom nanopore membran filtre. Presentert justering faktorer A_f var beregnet fra 2D liten vinkel neutron spredning (San) mønstre av en DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molar forholdet 16:4:5:5) prøve ekstrudert gjennom enten 800, 400, 200 eller 100 nm porene. SANS målinger er en utfyllende måte å kvantifisere bicelle justering som ikke dekkes i mer detalj her. ^{11 , 16} the A_f varierer fra -1 (parallell neutron spredning eller loddrett justering av bicelles med hensyn til magnetiske feltet retning) til 0 for isotropic spredning.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Strukturen på bicelles har blitt grundig studert av en rekke karakterisering teknikker. ¹³ justeringen av bicelles utsettes for et magnetfelt har vært kvantifisert med NMR spektroskopi eller liten vinkel neutron spredning (San) eksperimenter. ^{5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25} men Skift og utvidelse av NMR toppene forekommer i nærvær av Ln^{3 +} er alvorlige begrensninger for metoden. ^{15 , 26 , 27 , 28} men SANS eksperimenter lider ikke av denne begrensningen, alternative og mer tilgjengelig teknikker er ønskelig for rutinemessig kvantifisering av magnetisk induserte tekstjustering samlinger i løsningen. Birefringence mål er en levedyktig og relativt enkelt alternativ. Analogt til NMR eksperimenter avsløre birefringence målinger verdifull informasjon om lipid rearrangements og lipid fasene forekommer i bilayer. Videre geometriske transformeringer forekommer i samlingen polymolecular med endring av forhold som temperatur, overvåkes. ^{11 , 12 , 13 , 16} magnetisk indusert birefringence Δn′ har blitt brukt til å studere ulike typer phospholipid. ^{13 , 29 , 30} birefringence målinger basert på fase moduleringsteknikk i et magnetfelt er en levedyktig metode for å finne retningen på bicelles. ^{12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32} muligheten for å undersøke bicelles med birefringence i høy magnetfelt til 35 T ble også demonstrert av M. Liebi et al. ¹³

Når polariserte lyset går inn i en Anisotrop materiale, vil det være brytes i en ordinære og ekstraordinære bølge. ¹¹ to bølger har forskjellige hastigheter og er forskjøvet i fase en retardasjon ses. Graden av retardasjon ses måles og omgjort til et birefringence signal å kvantifisere graden av anisotropy i materiell hjelp

(2)

hvor λ er bølgelengdeområdet av laser og d er tykkelsen på prøven. Fosfolipider er optisk Anisotrop deres optiske aksen sammenfaller med sine lange molekylær akser, parallelt hydrokarbon haler. ^{11 , 12} ingen retardasjon måles hvis fosfolipider er tilfeldig orientert i løsningen. Retardasjon måles når fosfolipider justeres parallell til hverandre. Magnetisk indusert birefringence kan ha et positivt eller negativt fortegn avhengig av retningen på molekylene i magnetfeltet; se figur 2. Fosfolipider linje parallell til x-aksen vil resultere i en negativ , mens de justert langs z-aksen medføre en positiv . Ingen birefringence er observert når den optiske aksen faller sammen med retningen av lys overføring som phospholipid justerer parallelt med y-aksen.

Figur 2: Justering av fosfolipider og tilsvarende tegn på magnetisk indusert birefringence . Tegnet av den målte avhenger av retningen på phospholipid i magnetfeltet. Stiplede linjer viser den optiske aksen molekylet. Lyset er polarisert på 45° og overfører i y-retningen. Det magnetiske feltet B er i z-retningen. Dette tallet er endret fra M. Liebi. ¹¹ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ved en isotropic kolloidalt suspensjon av bicelles gå retningen av ordningen med fosfolipider i bilayer tapt, nullstille retardasjon ses. Bicelles må også justere for å orientere de optisk aktive fosfolipider i deres bilayers, forårsaker en retardasjon ses polariserte lyset. Derfor er birefringence en følsom verktøyet å kvantifisere den magnetiske alignability av polymolecular samlinger. Bicelles justert vinkelrett på det magnetiske feltet vil gi en positiv , mens de justert parallell vil gi en negativ . Tegnet avhenger av oppsettet og kan kontrolleres med en referanse prøve.

Protocol

1. fabrikasjon prosedyre for DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) og DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) polymolecular samlinger Foreløpig forberedelser Vask alle glass ved flushing gang med etanol stabilisert kloroform (> 99% kloroform) og tørt med trykkluft. Lage 2 forskjellige 10 mg/mL lager løsninger av DMPC og DMPE-DTPA i etanol-stabilisert kloroform (> 99% kloroform), en 10 mM lagerløsning Chol-oh i etanol-stabilisert klo…

Representative Results

Birefringence signalet fra en ikke-ekstruderte DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) eksempel var overvåket under en 5.5 T magnetiske felt under en oppvarming og avkjøling syklus fra 5 til 40 ° C og tilbake med en hastighet på 1 ° C/min (figur 6). Birefringence resultatene bekreftet høy magnetisk justeringer på 5 ° C med en verdi av 1,5 x 10-5, dobbelt så sterk som rapporterte ekstrudert systemer. 6</sup…

Discussion

En detaljert redegjørelse for hvordan birefringence-målinger ble brukt i kombinasjon med SANS eksperimenter for å evaluere metoder for å generere svært magnetisk forståelsesfull Ln^{3 +} chelaterande fosfolipider samlinger er Isabettini et al. ²³ de foreslåtte fabrikasjon protokollene gjelder også for samlinger består av de lengre DPPC og DPPE-DTPA fosfolipider eller de som inneholder kjemisk utviklet steroid derivater i deres bilayer. ^{11 ,</s…}

Materials

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Thulium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439649	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Dysprosium(III) chloride	Sigma-Aldrich	325546	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Ytterbium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439614	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Chloroform	Sigma-Aldrich	319988	contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	≥99.9%
Cholesterol	Amresco	433	Ultra pure grade
D2O	ARMAR chemicals	1410	99.8 atom % D
Ultrapure water	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
electronic pH meter	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter	VWR	515-2032
Whatmann Filter paper	VWR	230600
25 ml round bottom flask	VWR	201-1352	14/23 NS
3 ml glass snap-cup	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
2.5 ml glass syringe	Hamilton
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Merk	1.06342	Salt used to make phosphate buffer
di-Sodium hydrogen phosphate	Merk	1.06586	Salt used to make phosphate buffer
Liquid Nitrogen	Carbagas	–
Pressurized Nitrogen gas	Carbagas	–	200 bar bottle
Lipid Extruder 10 ml	Lipex	–	Fully equipped with thermobarrel
High-pressure PVC tube	GR NETUM	–	must resist more than 4 MPa
Serto adaptors	Sertot	–
Nitrile gloves	VWR	–
2 ml glass pipettes	VWR	612-1702	230 mm long
Diode Laser	Newport	LPM635-25C
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier	SRS	SR830
Photodiode Detector	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silicon, photo-conductive
5.5 T Cryogenic Magnetic	Cryogenic/Oerlikon AG	–	12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
Second order low pass filter	home-built	–	Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Photoelastic modulator	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Calcite Polarizer	Newport	10GT04	25.4mm diameter
Quartz sample cuvette	Hellma	165-10-40	temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
Temperature probe	Thermocontrol	–	Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
Non-polarizing mirrors	Newport	50326-1002	25.4mm
RS 232 cables	National Instruments	189284-02	For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
BNC 50 Ω cable and connectors	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National Instruments	–
Industrial power supply	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Waterbath	Julabo	FP40-HE	refrigerated/Heating Circulator