Summary
Bu makalede insan fetal beyin sinir kök hücreleri kültür, hem de onları içine çeşitli nöronal alt türlerini ve astrocytes sinir kök hücreleri Zika virüs enfeksiyonu çalışmaya kullanımı üzerine vurgu ile ayırt etmek nasıl genişletmek için kullanılan yöntemleri ayrıntıları.
Abstract
İnsan fetal beyin sinir kök hücreleri insan gelişimsel Nörobiyoloji üzerinde çeşitli uyaranların etkisini incelemek için benzersiz olmayan genetiği değiştirilmiş modeli sistemi vardır. Daha doğrusu bir hayvan modeli ya da genetik olarak değiştirilmiş İndüklenmiş pluripotent hücreler kullanımına oranla, insan sinir kök hücreleri tedaviler, ekran uyuşturucu, etkilerini incelemek veya bireysel farklılıklar incelemek için bir etkili vitro sistemi sağlama. Burada, insan fetal beyin sinir kök hücreleri kültür onları içine çeşitli nöronal alt türlerini ve astrocytes yolu ile farklı astar yordamlar, ayırt etmek ve donma ve kurtarmak için serum-Ücretsiz medya ile genişletmek için kullanılan bir yöntem için detaylı protokolleri sağlamak Bu hücreler. Ayrıca, biz insan fetal beyin sinir kök hücreleri Zika virüs enfeksiyonu çalışmaya kullanmanın bir açıklayınız.
Introduction
Zika virüstür (ZIKV) cinsel ya da sivrisinek vektörel çizimler Aedes aegypti ve Aedes albopictus sivrisinekler tarafından iletilen bir flavivirus. ZIKV son zamanlarda iletim kolaylığı nedeniyle şiddetli halk sağlığı tehdit olarak tespit edildi ve nörolojik belirtiler1bağlı. En nörolojik etkileri ile ilgili olduğunu microcephaly fetus enfekte hamile anneler2,3' e tarihi gelişimi. Microcephaly baş fetal gelişim sırasında ve çevresi daha az 2 standart sapma ortalama4aşağıda ile doğumda normal boyutundan daha küçük nerede bir nörogelişimsel bozukluktur. Küçük baş çevresi yaygın gelişimsel gecikmeler, nöbetler, görme ve işitme kaybı ve zorluk besleme gibi comorbidities çeşitli eşlik ediyor.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda hayvan modellerinde kullanılan veya pluripotent kök hücreler açıkların5,6,7,8ZIKV enfeksiyon etkisini incelemek için indüklenen. Bu çalışmalar için ZIKV, farklı tür kullanımı ile ilgili bilgilerimizi bulunmuştur ya da genetik olarak değiştirilmiş hücreler ve/veya zaman alıcı ZIKV etkisi üzerinde yıkmak başka değişkenler eklemek iken sinirsel geliştirme5, hücreleri 6 , 7 , 8. ancak, zorluk ile hNSC kültür, özellikle bu protokol için açıklanan yapışık olmayan neurosphere Kültür Kültür Kültür9yapmak için kullanılan yöntemleri çok hassas olmasıdır. Herhangi bir değişiklikten orta bileşenleri veya kültür gemi bile fiziksel işlenmesi bir tepki hücreleri9temin için yeter. Bu sorunlara yönelik olarak geliştirdiğimiz bir vitro insan fetal beyin kaynaklı nöral kök hücre (hNSCs) kültür mechanistically ZIKV etkisi fetal sinir kök hücreleri sorgulamaya. Bizim yöntemini kullanarak, hNSCs olmadan belirgin fenotipik değişiklikler1080'den fazla pasajlar için muhafaza. Ayrıca, Trizomi gibi kromozomal değişiklikler ya yok edildi ya da en az11. Bu hNSC kültür bir yapışık olmayan neurosphere kültür olarak büyür. Bir neurospheres küreler içinde vivo niş iki boyutlu kültürler9' a göre daha yansıtıcı kültür benzersiz bir çevre niş oluşturun avantajdır. Bu iletişim kuralı bir diğer avantajı hNSC hayatta kalma ve farklılaşma belirtilen değişkeni etkisini gözlemlemek için bir dedektif etkinleştirme birden çok hücre tipleri hNSC kültüründen türetilebilir var. Bu iletişim kuralı, merkezi sinir sistemi geliştirme veya fonksiyon bozukluğu ile ilgili mekanik sorulara cevap arayan kullanıcılar için geçerlidir. Aşağıdaki iletişim kuralı ile ZIKV bulaştırmak ve sonradan ortaya çıkan enfeksiyon farklılaşma süreci etkisini gözlemlemek için hNSCs ayırt etmek için bir hNSC kültür genişletmek nasıl açıklar. Ayrıca hNSCs uzun vadeli kullanım için depolamak ve daha fazla beyin malformasyonu11' e katkıda ZIKV kaynaklı açıkları incelenmesi izin nöronların çeşitli türleri içine hNSCs ayırt etmek için yöntemler içerir. Bu iletişim kuralı da enfeksiyon veya toksinler nöral kök hücre hayatta kalma ve farklılaşma gibi çevre herhangi bir uyarıcı etkisini anlamak isteyen araştırmacılar için ilgi olduğunu düşünüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan sinir kök hücreleri aslında ilk üç aylık12atılan insan cenin başparmaklarınız elde edilmiştir. Tüm iletişim kuralı yordamları insan doku örnekleri kullanımıyla ilgili Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi etik kurallara uygun ve hücre hatları kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. stok orta hazırlık ve kök hücre kurtarma
- Kültür orta stok (DFHGPS) adımları 1.1.1.-1.1.5 reaktifleri birleştirerek hazırlayın.
- Dulbecco'nın modifiye kartal orta ile yüksek glikoz ve L-glutamin (D) 210 mL ekleyin. Onu 4 ˚C saklayın.
- 70 mL L-glutamin takviyesi (F) ile Ham'ın F12 besin karışımı ekleyin. Onu 4 ˚C saklayın.
- 15 mM 4,2 mL ekleyin HEPES tampon (H) ve oda sıcaklığında saklayın.
- %10 4,2 mL ekleyin D-glikoz çözüm (G) ve oda sıcaklığında saklayın.
- 2,88 mL penisilin/streptomisin (PS) çözeltisi ekleyin. Aliquot hisse senedi çözüm içine 3 mL aliquots ve aliquots-20 ° c kadar gerekli saklayın.
Not: 100 adet/mL penisilin orta son konsantrasyonu olacak ve streptomisin konsantrasyonu 100 µg/mL olacaktır. Bu orta DFHGPS protokol geri kalanı için sevk edilecek ve 1-2 hafta içinde kullanılmak üzere 4 ° C'de muhafaza edilmelidir. Gerekirse, DFHGPS orantılı olarak ölçekli.
- Bir gün önce hücreleri kazanılmaktadır, bir T75 şişesi ile 5 mL şartına orta kat, hNSC hücre satırının önceki kültürler elde edilen ve 37 ° C kuluçka %8,5 karbondioksit (CO2) ile bırakın bir gecede.
Not: şu anda hNSCs kültür, hücre içinde orta değiştirmek sırasında büyüyen orta kaydedin. Bu "hücreleri tarafından şartına gibi" şartına orta bu. Şartına orta bir vidalı kapak tüp içinde kaydedilen ve 4 ° C'de yaklaşık 7 gün boyunca saklanır. HNSCs almak için ilgili yazarına başvurun. Klimalı orta kesinlikle ancak bu zorunlu değildir, özellikle ilk hNSCs kültürünü yeniden başlatırken tercih edilir. - Kurtarma, günün DFHGPS 20 mL için en az 10 dk. 37 ° C su banyosunda 50 mL vidalı kapak tüp içinde sıcak ve kullanıma hazır kadar su banyosu içinde saklayın.
- Bir ayrı 15 mL vidalı kapak tüp DFHGPS 10 mL için en az 10 dk. 37 ° C su banyosunda sıcak ve 1.13 adımda kullanıma hazır kadar su banyosu içinde saklayın.
- Bir kapsayıcı buz ve tüm Orta bileşenleri (Tablo 1) almak. Tüm Orta bileşenleri buz çözme ve orta değiştirmek için hazırlarken buz üzerinde bırakın.
- 5 mL (4 ° C'de depolanan) şartına orta stokunun elde etmek ve bir 37 ° C su banyosunda 1.14 adımda kullanıma hazır kadar tutun. Yok klimalı orta veya geçerli insan cenin nöral kök hücre kültürü ise Not adımdan sonra 1.2 bakın.
- Adım 1.3 den 50 mL vidalı kapak tüp almak ve içinde Biyogüvenlik Kabini (BSC) yerleştirin. DFHGPS 10 mL yeni 15 mL vidalı kapak tüp içine aktarmak ve 50 mL tüp içeren DFHGPS orta kalan 10 mL 37 ° C su banyosu içinde yeniden yerleştirin.
- Cryo şişe sıvı azot içinde depolanan hNSCs elde edilir. Geçerli hiçbir insan cenin nöral kök hücre kültürü ise Not adımdan sonra 1.2 bakın.
Not: İnsan sinir kök hücreleri aslında atılan insan fetal beyin12 den türetilmiş ve genetik değişiklikler10olmadan kültür saklanır. 5 × 106 hücreler çözdürülen ve bir T75 şişesi üzerinde kaplama. Her cryo-flakon 5 × 106 hücre içermelidir; Bu nedenle, bir şişe şişe başına gereklidir. - 37 ° C su banyosu hücrelerde bir şişe şişeyi ters çevirme tarafından her 10 çözülme s yaklaşık 1 dk ya kadar buz erimiş ve şişe içeriğini tamamen sıvı. Bütün şişeyi potansiyel kirlenmesini önlemek için su altında daldırın değil.
- BSC bir P1000 mikro-pipet çözdürülen hücre çözümü Aspire edin ve drop-wise DFHGPS 10 mL içeren adımından 1.7, 15 mL tüp eklemek için kullanın. Böylece sadece bir damla ya da iki kez yayımlanan drop-wise çözdürülen hücre çözümü eklemek için yavaş yavaş pistonu üzerinde bastırın. Bu arada, hızlı bir karışım izin verin için 15 mL tüp girdap.
- Hücre süspansiyon 200 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet korumak emin süpernatant, atın.
- 1.11 adımı sırasında adım 1.7 kalan 10 mL içeren 50 mL tüp almak. Santrifüjü sonra hücre Pelet 10 mL DFHGPS ve santrifüj 200 x g oda sıcaklığında 5 min için de tekrar resuspend.
- Son tur sırasında büyüme faktörleri için 10 mL DFHGPS orta adım BSC 1.4 (Tablo 1) eklemek için aşağıdaki Tablo 1 yeni büyüme orta hazırlayın. Kullanıma hazır kadar BSC büyüme faktörleri içeren yeni orta bırakın.
- T75 şişesi 1.2 adımından almak ve şişeye aspirasyon tarafından kaplama klimalı orta atın. Daha sonra 5 mL şartına medya de 1.6 adımından ekleyin. şişesi için serolojik pipet kullanarak. Balonun altındaki çizmemeye değil dikkatli olun.
- Hücre tüp santrifüj almak ve süpernatant, hücre Pelet dokunmadan aspirating tarafından atın.
- Hücre Pelet adım 1,13 yeni medya 10 ml 5 mL serolojik pipet kullanarak ve yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting resuspend. Süspansiyon kaplı T75 şişeye 1.14 adımından ekleyin. Kalan 5 mL hücre Pelet bulunan tüp durulama için kullanın ve bu 5 mL şişe için de ekleyin.
- T75 şişesi hücreleri şişeye arasında eşit olarak dağıtılır sağlamak için ileri geri 3 kez rock. Şişeye kapağı hava akışına izin gevşek olduğundan emin olun. Hafif bir mikroskop altında hücreleri gözlemlemek, notlar ve mümkünse fotoğraf çekmek.
Not: Hücreleri saydam ve küresel bakmak gerekir. O göz karanlık, opak varsa not yaz hücreleri veya asimetrik yatılı sahip olan bu hücre ölümü belirtebilirsiniz. Ayrıca renkli sarı haline medya gibi herhangi bir mantar veya bakteriyel kontaminasyon için dikkat et. - 37 ° C kuluçka %8,5 CO2hücre şişeye koyun.
Not: %8,5 7.1 7.4 aralığını Bu serum serbest kültür ortam pH korumak için % 5.0 CO2 yerine kullanın.
2. hNSC orta değiştirmek
Not: Orta her 3-4 gün değiştirin.
- BSC üzerinde açmak ve % 70 etanol ile iyice temizleyin. Hücreleri ışık mikroskop altında gözlemlemek.
Not: notlar hücrelerinin görünümü ve boyutları küre. Üç gün sonra kurtarma veya geçit, hücreleri birlikte küme ve yapışık olmayan neurospheres kurmaya başlar.
Dikkat: hücreleri şişeye altına bağlı olarak hücre yapışma erken farklılaşma artacak ve hücre-ecek âcizden kök durumunu korumak atılmak üzere kültür gerekir. Şişeye çok fazla hücreler varsa, hücreleri büyük küre (2 mm çapında büyüktür) bu durumda oluşabilir, kürenin Merkezi hücrelerde büyüme faktörleri orta erişim eksikliği nedeniyle ayırt etmeye başlayacaktır. Küre çapı 1 mm daha büyük gözlenir, hücreleri pasajlı (Adım 3.1-3,22) olabilir. - 1.4 ve 1.5 adımları izleyin ve 10 mL taze orta hazırlamak (bkz. Adım 1.13).
- Küreler şişeye altına lavabo izin tarafa Tilt şişesi.
- 5 mL şartına medya de herhangi bir neurospheres Aspire edin değil için dikkat çekici bir 5 mL serolojik pipet kullanarak havuza alınan orta üst kısmından kaldırın. 5 mL klimalı ortam temiz 15 mL tüp içine yerleştirin.
- Bir ek 5 mL klimalı ortam küreler, tekrar dikkatle kaçınarak balonun kaldırmak ve 5 mL aynı 15 mL tüp içine yerleştirin.
- Yeni medya 10 mL klimalı ortam ve şişeye hücrelerde kalan 5 mL adım 2.2 den ekleyin. Şişeye düz aşağı ayarlayın ve hücreleri ışık mikroskop altında gözlemlemek.
- Hücreleri şartına orta toplanması sırasında emişli görünürse, 100 x g oda sıcaklığında 5 min için şartına orta spin. 1 ml şartına orta alt biriken hücreler yeniden askıya alma ve onları kültür şişeye ekleyin.
- Adımları 4 ˚C 2.5/2.6 kullanılmayan şartına medyadan 10 mL 15 mL vidalı kapak tüp içinde saklayın.
- Adımları 1.17/1.18 tekrarlayın.
3. hNSC geçiş
Not: Normalde, saat iki katına nüfus olarak hücrelerin büyümesine izin verirseniz 9-11 günde yaklaşık 3 gün13geçiştir hNSCs olmalıdır.
- NSCs yeni bir şişesi genişleyen tüm yeni şişeler adım olduğu gibi 1.2 kaplanır emin olun.
- Adım 2.1 gibi lisans temiz ve adımları 1.4 ve 1.5 kuralları.
- Orta adım 1,13 olarak hazırlayın. Her T75 şişeye 10 mL orta gerektirir. Birden çok T75 Şişeler için medya şişeler sayısına göre 10 mL çarpın.
- Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (dPBS) ve glikoz ve 37 ° C su banyo 10 dakikadır (tripsin çözüm) göre Tablo 2' deki birimleri için sıcak bir yerde 1 veya 3 mL hazırlayın. Tripsin veya Dnaz şu anda eklemeyin. Dnaz mekanik veya kimyasal hücre ayrılma nedeniyle ölü hücrelerden serbest herhangi bir DNA yıkmak için gerekli.
Not: Bir T75 şişesi 9-10 gün sonra büyüme pasajlı yaklaşık 30 × 106 hücreler, 5 × 106 aslında şişesi üzerinde seribaşı eğer olacak. Genellikle, 1 mL dPBS çözeltisi 10 × 106 hücreler için kullanılır. Bu nedenle, 3 mL dPBS çözeltisi bir 9-10 gün sonra pasajlı T75 şişesi için gereklidir. - Yer temiz küçük ağırlık tekne ve hemasitometre mahallede. % 70 etanol ile temiz ve hava için yaklaşık 5 min için başlıklı kuru sağlar.
Not: Tartmak tekne 3.17.1 adımda kullanılacak. - Kuluçka makinesi passaged ve BSC getirmek hücreleri şişeye almak. Yavaşça havuza alınan medya altına batmaya hücreleri sağlayan şişesi eğ. Yaklaşık 15 mL şişeye medya vardır.
- Medya yaklaşık 10 mL 5 mL bölümleri (Yani 5 mL + 5 mL) kaldırın. Medya bu 10 mL "şartına orta için" "CM" etiketli bir temiz 15 mL tüp içine yerleştirin. Herhangi bir şişeye medyada kalan 5 mL yerleşmiş hücreleri Aspire edin değil dikkatli olun; Bu hücreler ve medya 5 mL tabi adım 3.8.
- 3 mL "CM" tüp (Kimden adım 3.7) şartına ortamdan alıp "tripsin inhibitörü çözüm" etiketli bir 15 mL tüp içine yerleştirin. Bu adımda 3.12 kullanılacaktır. 3 mL kaldırıldıktan sonra "CM" tüp klimalı ortam kalan 7 mL vardır. "CM" tüp adım kadar 3,9 bir kenara koyun.
- Medya ve T75 şişeye kalan hücreleri 5 mL kaldırmak ve "Hücre" etiketli bir temiz 15 mL tüp içinde yer.
- Klimalı ortam (Kimden adım 3.7.1) 7 mL içeren "CM" tüp al ve T75 şişeye alt iki kez 3,5 mL 5 mL serolojik pipet kullanarak şartına medya kısımları ile durulayın. Her durulama sonra 3,5 mL porsiyon "Hücre" tüp içine yerleştirin. Bu adımın amacı T75 balonun tüm neurospheres (hücre) kaldırmaktır.
- "Hücre" tüp 100 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Hücreleri iplik, dPBS/glikoz çözüm 37 ° C su banyosundan elde etmek ve tripsin ve Dnaz Tablo 2göre uygun miktarda ekleyin.
- "Hücre" tüp iplik durduktan sonra ve "CM" tüp transfer tüm klimalı orta süpernatant çıkarın.
- 3.7.1. adımdaki "tripsin inhibitörü çözüm" etiketli tüp al. ve Tablo 3' te belirtilen tripsin inhibitörü hacmi ekleyin. Tripsin inhibitörü çözüm aynı hacmi tripsin çözüm için kullanılan gibi kullanın.
- Tripsin inhibitörü çözüm gerekinceye kadar 37 ° C su banyosu içinde yerleştirin.
- Hücre Pelet 15 mL tüp tripsin çözüm ekleyin ve yukarı ve aşağı yaklaşık 5 - 10 kat ile 5 mL pipet pipet. Tüpün kapağı kapatın ve 5 min için 37 ° C su banyosunda kuluçkaya. 5 dk sonra hücreleri almak ve yukarı ve aşağı pipet 5 - 10 kat. Daha sonra ek bir 10-15 dk 37 ° C su banyosunda kuluçkaya.
- Son 5 dakika içinde tripsin inhibitörü çözüm için lisans taşıyın.
- Adım 2,14 tamamlandıktan sonra hücreleri almak ve küreler tamamen ayrışmış kadar hücreleri yukarı ve aşağı pipette (20 - 30 kere). Sonra hemen tripsin inhibitörü çözüm ve pipet yukarı ve aşağı 10 kez ekleyin. Bu çözüm Disosiye hücrelerin ve tripsin inhibitörü "hücre süspansiyon" ifade edilecektir.
- Hücre süspansiyon hücrelerinde aşağıdaki adımlarla saymak.
- Trypan mavi ön karışımı (%0,4 Trypan mavi ve 10 µL dPBS, 5 µL içeren) 15 µL bir küçük tartmak tekne pipet ve hücre süspansiyon 5 µL ekleyin. Aşağı yukarı 3 - 5 kere-pipet karıştırın. Daha sonra pipet 10 µL üzerine her iki tarafında bir hemasitometre Trypan mavi/hücre süspansiyon, bir cam coverslip ile kaplı.
- Hafif bir mikroskop altında hücreler gözlemlemek ve her birine dört köşe Izgaralar toplam sayısını saymak. Bu sayılar birlikte ekleyin.
- Diğer taraf için sayma tekrarlayın ve iki taraf birlikte ortalama.
- Bu sayı 10.000 mL başına hücre sayısı vermek çarpmak. Mililitre hücrelerde hücre süspansiyon toplam sayısını hesaplamak için toplam sayısı bu sayıyı çarpın. Hücre süspansiyon ne kadar hacmi T75 şişe başına 5 milyon hücre tohum için gerekli hesaplar.
Not: Genellikle, 9-10 gün sonra bir T75 25-30 × 106 hücreler sahip olacaktır. Bu nedenle, tüm hücreleri yeni şişeler passaging, 5-6 şişe toplam gereklidir. - Şişe başına 5 × 106hücre elde etmek için her T75 şişesi 3,19. adımda hesaplanan hücre süspansiyon hacmi ekleyin. Birim daha az 5 mL 5 mL toplamda için telafi etmek için ek koşul orta ekleyin. Daha sonra yeni DFHGFPS medya içeren büyüme faktörleri (Tablo 1) 10 mL şişe için ekleyin.
- 1.17 ve 1,18 numaralı adımları yineleyin ve şişeye hücreleri, tarihleri, şişeye hücre sayısı ve (Bu hücreyi pasajlı sayısıdır) geçiş numarası türüyle etiketli emin olun. Daha sonra merdiven 4-9-e doğru taşımak.
- İçine gerekli, tohum ekstra hücreleri Eğer yoğunluğu, bir T75 şişesi şişe başına 30 × 106hücre gecede kazanma ve adım 4 göre ertesi gün dondurma.
4. hNSC donma ve depolama
- Gün passaging sonra şişeye (adımından 3,19 ve 3,22) dondurma için hücreleri içeren kombine kuluçka makinesi al. Şişeye eğilme ve tüm Orta ve hücreleri şişesi ve 15 mL tüp yerde kaldırın. O zaman vasıl 216 x g 5 min için tüp santrifüj kapasitesi.
- Santrifüjü işlemi sırasında donma orta (Tablo 4) hazırlayın. Her 5 × 106 hücre dondurma orta 1 mL hazırlayın. Hücre sayısı adımda 3,19 her şişeye koymak için kaç hücre belirlerken tespit edilmiştir. Bu sayı bir gecede değişmedi.
- Cryo-koru tüpleri hücre adı, geçit numara, cep numarası, baş harfleri ve tarihi etiketlerle hazırlayın. Santrifüjü sonra süpernatant aspirasyon tarafından kaldırmak ve böylece 5 × 106 hücre/mL orta dondurucu içinde hücre Pelet yeniden askıya alma. Aliquot 5 mL pipet 1 mL flakon ve mühür başına sıkıca kullanarak (şişe başına 5 × 106 hücre).
- İsopropanol (isopropanol yerine başına 5 kez maksimum kullanım) 250 mL cryo-koru kapsayıcıyla şişeleri yerleştirin. -80 ° C dondurucuya gecede depolamak ve bir sıvı azot tankı depolama sistemine aktarmak.
5. doğrulama için yapisan hNSC kaplama
- Bir gün passaging önce (Adım 3.1-3,22), BSC adım 2.2 olduğu gibi temiz ve 24-şey plaka ve steril cam 12 mm coverslips elde edilir.
- Forseps kullanarak, tek bir coverslip kuyunun her plaka yerleştirin.
- Kapak torbalarla % 0,01 Poli-D-lizin (PDL) içeren wells steril su ceket ve 37 ˚C 1 h için kuluçkaya. 24-şey plaka için PDL 250 μL iyi kullanın.
- Bu PDL genel kuyulardan kaldırın ve sonra 1 µg/cm2 laminin/dPBS (iyi başına 250 μL) ile kat. Gecede 37 ° C'de plaka kuluçkaya Aksi takdirde ertesi gün parafilm plaka kenarlarını etrafında sarma tarafından parafilm ile plaka mühür ve 4 ° C'de depolayın
Not: laminin ile kaplı plakalar için 2 hafta kapak paket fişi değil kuru olarak parafilm ile mühürlü saklanabilir. - Geçiş hücreleri olarak açıklanan adımları 3.1-3,22 ve sonra 24-şey plaka ile kaplı coverslips içine tohum hücrelerinin sayısını belirleyin.
- Aspirasyon yoluyla kuyulardan herhangi bir aşırı laminin çözümü kaldırmak ve bir kez dPBS 0.5 mL ile durulayın. Sonra hücreleri bir yoğunluğu 0,6-1 x 105 hücreleri/cm2 iyi, kuyu içine tohum. Adımları 3,16-3.21 göre kalan hücreler kullanın.
- 24-şey plaka kültür, Atvarious zamanlarda tamir ve adım 9 takip çeşitli kök hücre işaretçileri için hücreleri leke.
6. GABA ve Glutamat nöronlar almak için astar
- 3.1-3,22 açıklandığı gibi hücreleri geçiş ve sonra 24-şey plaka adım 5.6 olduğu gibi içine tohum hücrelerinin sayısını belirleyin.
- Astar, önceki gün kapak fişleri ve 5,1-5,4 adımlarda açıklandığı gibi kat plaka hazırlayın.
- Astar günde 2-3 günlük hücreleri içeren şişe almak. Bir 15 mL tüp içinde koyun ve 5 min için 100 x g de centrifuging tarafından hücreleri cips.
- Epidermal büyüme faktörü/lösemi inhibitör faktörü/laminin (ELL) astar orta Tablo 5göre hazırlayın.
- ELL orta hücrelerle resuspend.
- Tohum hücreleri bir 24-şey plaka (takip adım 5.6) askıya aldı.
7. motor nöronlar almak için astar
- 6.1 6.4 adımları.
- Temel fibroblast büyüme faktörü/Heparin/Laminin (FHL) astar orta Tablo 6göre hazırlayın.
- Adım 5.6 izleyin.
8. Zika virüs enfeksiyonu
Not: ZIKV sıcaklık için son derece hassas, bu yüzden ZIKV hisse senedi, - 80 ° C ve donma/çözülme döngüsü depolanır zorunluluk kaçınılması. Aliquots buz üstünde çalışmaya devam et.
- 3.1-3,22 adımlarda açıklandığı gibi geçiş hücreleri. Toplam 3-4 milyon hücre passaging, koymak zaman enfeksiyon için gerekli ve ne zaman passaging bir şişeye tohum hücrelerinin sayısı 24-şey plaka, bu nedenle temel için ihtiyaç vardır.
- Hücre boyama için 24-şey plaka içine tohum, coverslips ve plaka adımları 5,1-5,4 göre hazırlamanız.
- Passaging sonra 200 x g 5 min için oda sıcaklığında 1 mL hücre süspansiyon adım 8.2 1.5 mL microcentrifuge tüp ve santrifüj içine yerleştirin. Sonra süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın.
- Pelet adım 8.3 ZIKV hisse senedi enfeksiyon (MOI) ya da 1'den 10 çokluğu elde etmek için resuspend. ZIKV çözüm hacmi 0.5 mL aşmaması gerekir. (Kontrol hücreleri) sahte tedavi için aynı birim ve orta ZIKV stok kullanılan türde hücrelere resuspend.
Not: Bir önceki yayın11' ZIKV hisse senedi hazırlık ve enfeksiyon açıklanmıştır. Sahte enfeksiyonlar da orta ile yapılmaktadır. - 1 h. tüp 2 - 3 kez ters çevir ve karışımı 216 x g oda sıcaklığında bir hücre Pelet elde etmek için de 5 dk santrifüj kapasitesi cep/ZIKV karışımı 37 ° c üzerinde kuluçkaya. 216 x g oda sıcaklığında, dPBS ve santrifüj 5 min için tekrar Pelet resuspend.
- Süpernatant aspirasyon tarafından kaldırmak, uygun orta hücrelerle resuspend ve enfekte hücreleri şişesi veya deneme için gerekli plaka yüklemek. Hücreleri bir 24-şey plaka tohum Pelet 12 mL uygun orta resuspend ve her şey için süspansiyon, 500 μL ekleyin.
Not: Bu noktada kök hücre ZIKV etkilerini gözlemlemek için büyüme medya hücreleri korumak veya 6 veya 7 farklılaşma süreci ZIKV etkisi çalışmaya adımlara geçin.
9. boyama prosedürü
- Hücreleri düzeltmek için orta kaldırmak için bir kez de (24-şey plaka) buz soğuk fosfat tamponlu tuz (PBS) başına 0.5 mL ile durulayın.
- PBS, kaldırmak ve PBS %4 paraformaldehyde 0.5 mL hücrelerle kapak ve 20-30 dakika oda sıcaklığında bekletin.
- Paraformaldehyde kaldırmak ve hücreleri üç kez PBS üçüncü PBS durulama oda sıcaklığında 10 dakika için bırakarak, 0.5 mL ile durulayın.
- Bu noktada PBS gece bırakın ve 4 ˚C plaka depolamak veya 10 dk durulama sonra boyama başlar.
- 10 dk PBS durulama sonra 45-60 dk % 5 normal keçi serum (NGS), % 0.3 sığır serum albumin (BSA), 0,5 mL solüsyon ile sabit bir pozisyonda için hücreleri % 0.25 engellemek Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS) Triton X-100. Örneğin, 1 mL çözüm kullanımı engelleme yapmak için: %25 10 µL Triton X-100, %100 50 µL NGS ve % 3 BSA 100 µL karışık TBS. 840 µL içinde
- Engelleme adımı sırasında tüm reaktifler buz üstünde tutulur emin birincil antikor çözüm hazırlamak. HNSCs doğrulamak için Nestin gibi proteinler onlara karşı uygun antikor kullanılarak hedeflenebilir. ZIKV enfeksiyon doğrulamak için bir antikor ZIKV kat protein11karşı kullanın. Farklılaşma için işaretleri Class III β-tübülin gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) astrocytes tanımlamak için kullanılan süre nöron popülasyonları tanımlamak için kullanın. Birincil antikorlar konsantrasyonları ampirik olarak satıcı ve çok bağlı olarak belirlenir. Biz-si olmak kullanılmış en 1: 100 1:2000 seyreltme için antikorlar.
- 12.000 x g 4 ° C'de 2 min için de birincil antikor santrifüj kapasitesi ve bir seyreltme yapın; Örneğin 1: 1000 seyreltme antikor, yapmak için istenen antikor 7.2 mL % 0.25 içine 7.2 µL ekleyin TBS. Triton X-100
- 24-şey plaka her şey için yaklaşık 300 µL antikor çözüm ekleyin ve sabit bir pozisyonda gecede oda sıcaklığında veya 4 ˚C 2 h için sabit bir pozisyonda birincil antikor hücrelerle kuluçkaya.
- Kuluçka sonra TBS 0.5 mL üç kez, oda sıcaklığında sabit bir pozisyonda her 10 min için hücrelerle yıkayın.
- 12.000 x g 4 ° C'de 2 min için de ikincil antikor santrifüj kapasitesi sonra % 0.25 Triton X-100/TBS çözümde oranında seyreltin. Her şey için 300 µL eklemek için yeterli antikor çözüm olun. Burada, floresan ikincil antikorlar 1:500 (şekil 3) oranında seyreltin.
- Son TBS yıkadıktan sonra her şey için ikincil antikor çözüm 300 µL ekleyin ve sabit bir pozisyonda oda sıcaklığında 1 h için karanlıkta kuluçkaya. Şu andan itibaren tüm adımları karanlık bir odada yer almalıdır.
- Bulunduğu hücreleri TBS sabit bir pozisyonda her 10 min için üç kez yıkayın.
- Son 10 dk yıkama sırasında DAPI nükleer leke TBS (genellikle 1:1,000 - 1:5, 000) önerilen konsantrasyonu nükleer marker sulandırmak. Her şey için 300 µL eklemek için yeterli bir çözüm yapmak.
- Son yıkama sonra her şey için 300 µL DAPI çözüm ekleyin ve sabit bir pozisyonda oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Sonra bir kez TBS. 0.5 mL ile yıkayın
- Bir anti-fade montaj orta floresan ve slayt üzerinde yer alacak coverslip başına 1 damla (10-15 µL) için kullanın. Dikkatle coverslips 24-şey plaka kuyulardan çıkarın ve montaj orta bırakıldığında slaytta aşağı hücre yüzeyine yerleştirin için cımbız kullanın.
- Coverslips slayt üzerinde yerleştirilir sonra slayt düz bir slayt-sahibi yerleştirin. Etiket slaytlara emin olun bu slaytta hücreleri tanımlamak sonra alüminyum folyo ile sahibi slaytlar ışıktan korunan tutmak için kapak için gerekli tüm bilgileri olacak.
- Slaytları 4 ˚C, depolama ve gecede kuvvetlendirmek için montaj orta sağlar. Ertesi gün, UV-2E/C filtre (340-380 nm), GFP HYQ BP filtre (450-490 nm) veya Y-2E/C Texas ile bir epifluorescent mikroskop kullanarak slayt gözlemlemek kırmızı filtre (540-580 nm), 20 X büyütme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onların proliferatif aşamasında kültürlü hNSCs yapışık olmayan neurospheres (şekil 1) büyüyecek. Hemen hNSC geçiş, toplamak ve form alanları için önümüzdeki birkaç gün içinde (şekil 1A ve 1B) başlamak birçok tek tek hücreler bulunur. Sağlıklı küreler yaklaşık 1-2 mm çapında bir geçit (şekil 1 c) 9-10 gün olmalıdır. 2 mm'den daha büyük büyümek küreler karanlık bir merkezi geliştirecek ve büyüme faktörleri Orta Merkezi kürenin içinde istenmeyen farklılaşma sonucu hücrelerde ulaşmak mümkün olmayacaktır. Sağlıklı küreler yarı saydam görünür ve küre (şekil 1 c) kenarlarında sahte kirpikler görüntüler.
Neurospheres yapisan bir yüzey üzerinde boyama amaçlı kaplama yapisan küreler (şekil 2A) büyüme neden olur. Bu küreler kültür gemisi yüzeye dokunun ve gemi, yüzeyde uzanan Merkezi küre (şekil 2A) korunarak bazı tahminler var. Astar ve hücreleri ayırt hücrelere bir 24-şey tabak gibi bir hücre kültür tabak dibinde bir kapak notu uygun gerektirir. Uygun astar adımları ve farklılaşma orta eklenmesi aşağıdaki hücreler kültür gemi yüzeyi boyunca yayılmış ve hücreleri (şekil 2B) birbirine bağlı monolayer büyümek.
Ya hNSC kültür geçerliliğini veya fenotip farklılaştırılmış hücrelerin onaylamak için floresan immünhistokimya kullanılabilir. Nestin genellikle NSCs içinde ifade bir ara filaman ve hNSC kültür (şekil 3A) doğrulamak için kullanılır. Farklılaşma takip nöronlar varlığını denetlemek için sınıf III β-tübülin genellikle etiket nöronlar (şekil 3B) için kullanılabilir. Astar adım farklılaşma takip nöronlar daha yüksek bir yüzdesi elde etmek için kullanılmasına rağmen hala olacak astrocytes kültüründe. Gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) astrocytes veya nöronlar farklılaştırılmış hücrelerin hangi yüzdesi oldu ölçmek için etiket astrocytes için kullanılabilir.
NSCs K048 hattı immünfloresan ile belirli bir ZIKV antikor boyama tarafından tespit ZIKV Afrika ve Asya suşları tarafından enfekte olduğunu bulduk. Temsili resim şekil 4' te gösterilmiştir. Sahte enfeksiyon hNSC Morfoloji ya da hayatta kalma (şekil 4A, 4 C) bir değişiklik temin değil. ZIKV 1 saat enfeksiyon bir enfekte hücre bir gün sonrası periferik bölgede kalmak eğilimindedir, ancak tüm cep telefonu 3-7 gün (şekil 4B4 D, 4E) doldurur. Fark, aynı MOI ile (0,1), bir tahmini % 5 enfeksiyon K048 hücreleri bu son zamanlarda ZIKV rapor daha önemli ölçüde daha düşük oranıdır enfeksiyon oranı (% 80) insan deri kaynaklı NSCs7' de. Bu çalışmada % 80 infektivite, raporlama, prototip Afrika strain neurotropic fenotip fare beyin hücreleri 140 pasajlar sırasında adapte olması ZIKV (MR766) kullanılır.
Şekil 1: parlak alan görüntüleri hNSC kültür. (A-C) Passaging sonra hNSC kültür 1, 4 ve 9 gün 10 X büyütme, sırasıyla temsilcisi parlak alan görüntüler. Ölçek çubukları: 60 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: parlak alan görüntüleri yapisan kültürlerin. (A) 10 X büyütme 7 gün sonra kaplama yapisan hNSC kültürünün, çekilen temsilcisi parlak alan görüntüler. (B) temsilcisi parlak alan görüntüleri yapışık 10 X büyütme oranında alınan ELL takip hücreleri ayrıştırılan astar ve farklılaşma 9 gün. Ölçek çubukları: 60 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: hNSCs ve farklı kültürleri floresan görüntülerini. (A) yapisan hNSCs nükleer marker, DAPI (mavi) ve kök hücre işaretçisi Nestin ile lekeli 20 X büyütme, (kırmızı) temsilcisi floresan görüntüler. Ölçek çubuğu: 60 µm (B) temsilcisi floresan görüntüleri çekilen sinirsel işaret βIII-tübülin (yeşil), astrocyte makinesi GFAP'nin (kırmızı) ve nükleer marker DAPI ile lekeli farklılaştırılmış hücrelerin 60 X büyütme (mavi). Ölçek çubukları: 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: ZIKV enfeksiyon insan fetal beyin elde edilen NSCs. İnsan NSCs ya alay tedavi (A ve C), aşılamaya 1 saat ZIKV MOI 0.1 (B ve D) adlı bir Afrika lineage zorlanma ya da son zamanlarda sivrisinekler Meksika dan 2016 yılında (E) izole ZIKV Asya bir tür. İmmünfloresan boyama bir-yedi gün sonrası aşılama (1 dpi çözünürlüğe B, d 7 dpi ve e 3 dpi) adlı NSCs ZIKV antikor etiketlerine göre algılar. Ölçek A-D ve 5 µm e. 10 µm barlar Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Bir T75 için DFHGPS medya | 10 mL |
| TPPS * | 173 ΜL |
| 200 mM L-Glutamin | 50 ΜL |
| 10 mg/mL insülin ** | 25 ΜL |
| 20 µg/mL Epidermal büyüme faktörü | 10 ΜL |
| 20 µg/mL temel fibroblast büyüme faktörü | 10 ΜL |
| 10 µg/mL lösemi engelleyici faktör | 10 ΜL |
| 5 mg/mL Heparin | 10 ΜL |
| * 100 µg/mL Transferrin, 100 µM putresine, 20 nM progesteron ve 30 nM sodyum selenit içeren karışımı. Karışım konsantre stokları yapılır ve aliquots-80 ° C'de saklanır ve preferablly 6 hafta hazırlık içinde kullanılır. Konsantre hisse senetleri 10 mg/mL transferrin, 30 mM putrescine, 10 µM progesteron ve 15 µM sodyum selenit-80 ˚C saklanan vardır. | |
| ** İnsülin N 0.2 µM düşük protein bağlama filtresi filtre ve 6 haftaya kadar 4 ˚C depolanan klorür, hydroen 0,01 feshedilmiştir. | |
Tablo 1: büyüme faktörleri yeni nükleer silahların yayılmasına karşı orta için.
| dPBS * | 1 mLbir | 3 mLb |
| % 10 glikoz | 60 ΜL | 180 ΜL |
| % 2.5 Tripsin | 10 ΜL | 30 ΜL |
| Dnaz ** | 5 ΜL | 15 ΜL |
| * Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz | ||
| ** Deoksiribonükleaz | ||
| bir 10 milyon hücre için | ||
| b 30 milyon hücre için | ||
Tablo 2: Tripsin hazırlanması.
| Klimalı ortam | 1 mLbir | 3 mLb |
| Tripsin inhibitörü | 10 ΜL | 30 ΜL |
| bir 10 milyon hücre için | ||
| b 30 milyon hücre için |
Tablo 3: Tripsin inhibitörü hazırlanması.
| DFHGPS * | 0.7 mLbir | 2.1 mLb |
| FBS ** % 20 | 0.2 mL | 0.6 mL |
| DMSO *** % 10 | 0.1 mL | 0.3 mL |
| * DMEM, F12, HEPES, glikoz, penisilin-streptomisin | ||
| ** Fetal sığır serum | ||
| Dimetil sülfoksit | ||
| bir bir şişe hücrelerde 5 milyon için | ||
| b üç şişe için 5 milyon hücre/flakon | ||
Tablo 4: hazırlık dondurucu orta.
| DFGHPS * bir 24-şey plaka bir kuyu | 1 mL |
| TPPS ** | 17,3 ΜL |
| 200 mM L-glutamin | 5 ΜL |
| 10 mg/mL insülin | 2.5 ΜL |
| 20 µg/mL Epidermal büyüme faktörü | 1 ΜL |
| 10 µg/mL lösemi inhibitör faktörü | 1 ΜL |
| 1 mg/mL Laminin | 1 ΜL |
| * İçeren DMEM, F12, HEPES, glikoz, penisilin-streptomisin | |
| ** 100 µg/mL Transferrin, 100 µM putresine içeren, | |
| 20 nM progesteron ve 30 nM sodyum selenit | |
Tablo 5: ELL astar orta hazırlanması.
| DFGHPS * bir 24-şey plaka bir kuyu | 1 mL |
| TPPS ** | 17,3 ΜL |
| 200 mM L-glutamin | 5 ΜL |
| 10 mg/mL insülin | 2.5 ΜL |
| 20 µg/mL temel fibroblast büyüme faktörü | 0.5 ΜL |
| 5 mg/mL Heparin | 0.5 ΜL |
| 1 mg/mL Laminin | 1 ΜL |
| * İçeren DMEM, F12, HEPES, glikoz, penisilin-streptomisin | |
| ** 100 µg/mL Transferrin, 100 µM putresine içeren, | |
| 20 nM progesteron ve 30 nM sodyum selenit | |
Tablo 6: FHL astar orta hazırlanması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kültür ve hNSCs çeşitli insan hastalık10,11,12,14eleme yüksek işlem hacmi uyuşturucu için modelleme gelen amaçlar için kullanılan kritik bir araç sağlar, 15,16,17. Nasıl insan fetal beyin NSCs gibi ele alınması gereken birçok soru kaldı ya da onların döl ZIKV enfeksiyon, olup ZIKV farklı suşları eşit etkinlik ile NSCs bulaştırmak, ve nasıl enfeksiyon sinirsel gelişim sırasında microcephaly içinde sonuç yatkındır. Biz bu hNSC kültür Zika ilişkili virüs nevropatoloji11,14araştırmak için kullandık. Üç soy-in üç bireysel bağış izole hücreler kullanarak, biz de nörolojik açıkları gözlenen aşağıdaki ZIKV enfeksiyon11duyarlılık için bireysel farklılıklar karşılaştırmak mümkün. Bu teknik sınırlamaları hNSC örnekleri için erişilebilirlik ve şartına orta için uygun kültür önemli biridir. Bu engeli aşmak için bu protokol için kullanılan hücre ticari olarak mevcut değildir gibi bir malzeme göndermek için ilgili yazarına başvurun.
İçinde vitro çalışmalar sadece hNSCs kullanarak temel kök hücre davranış içine benzersiz bilgi sağlar, ayrıca önceden klinik araştırma yapmak için mükemmel bir platform sağlamaktadır. Ancak, hNSCs kültür ve teknik zorluklar onları etkili ve tekrarlanabilir model olarak kullanarak bir engel olarak hizmet verebilir. Bu protokol için önemli adımlar ve yöntemleri kültür içinde değişkenliği azaltmak için kullanılan ve sağlıklı ve istikrarlı hNSC kök hücre kültür verim metodolojileri belirttiğimiz. HNSC neurosphere kültür kullanmanın bir dezavantajı hücreleri tüm uyaranlara karşı son derece duyarlı olmasıdır. Bile detaylı iletişim kuralı ile yukarıdaki gibi protokol belirsiz varyasyonlarında neurosphere davranış değişiklikleri neden olabilir ne kadar şişe veya hNSCs yemekleri işlenir, dikkat önemlidir.
Bu yöntemleri kağıt en önemli bölümü büyüme faktörü kokteyl ve farklı medya hazırlanması olduğunu. HNSC kültür katlama zaman çok düşükse veya birçok hücre adherie (yapışık olmayan gerekirken) kültür gemisine ilk adımı kullanılan büyüme faktörleri uygun toplama olduğundan emin olmak için ve dolmamış. Bu iletişim kuralı tüm büyüme faktörleri (5-6 gün) bir kez çözdürülen çok kısa bir raf ömrüne sahip. Ayrıca, biz büyüme faktörleri birden çok şirket üzerinden kullanılan ve kültürü korumak için gerekli kalite ve farklılıkları fark ettim. Bu nedenle, biz çok Malzeme tabloayrıntılı tam büyüme faktörleri kullanmanızı öneririz. Passaging adım (Adım 3.1-3,22) aynı zamanda hata ortak bir kaynağıdır. Ayrılma süreci takip birçok ölü hücreler varsa çok fazla fiziksel ayrışma hücre ölüme neden olabilir gibi yukarı ve aşağı hücreleri, ayırmak için pipetting kez sayısını azaltın. Alternatif olarak, hücre ayrılma adım takip birçok kümeleri varsa, kültürü uygun kalmayacak büyük küre canlılığı veya yukarı ve aşağı, bu kümeler pipetting bir kaç kez hızlı bir şekilde olacaktır artış olur. Kültür düzgün tutulur Eğer ZIKV ile enfeksiyon nispeten basittir.
ZIKV enfeksiyon bu protokol için ayrıntılı tedavi olsa da, çalışmalar geniş bir dizi için bu hNSC kültür sistemi kullanmak mümkündür. Bu modeli sistemi ilaçların ekran, bireysel duyarlılık incelemek ve çeşitli hastalıklar ve gelişimsel bozukluklar14temel mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir. Kültürlü hücreler değil genetik olarak manipüle ve hiçbir kromozom anormallikleri bile 80 pasajlar10,11için küçük gösterir beri bu sistem aynı zamanda genomik çalışmalar için idealdir. Enfeksiyon, uyuşturucu, alkol, toksinler, vb olabilir gibi çevresel uyaranlara sinir sisteminin gelişimine etkisi nasıl bu kültür sistem modelleme vitro için ideal olduğunu düşünüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu eser fonlarından John S. Dunn Vakfı ve insan enfeksiyonları ve Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi (PW) dokunulmazlık Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission - Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
