Aangepaste ontworpen weefselkweek mallen van Laser-geëtst meesters
Summary
Hierin presenteren wij een snelle, facile en goedkope methode voor het fabriceren van aangepaste Polydimethylsiloxaan mallen die kunnen worden gebruikt voor de productie van hydrogel gebaseerde gemodificeerde weefsels met complexe geometrieën. Daarnaast beschrijven we resultaten van mechanische en histologische evaluaties uitgevoerd op gemanipuleerde cardiale weefsels geproduceerd met behulp van deze techniek.
Abstract
Zoals het gebied van weefselengineering heeft voortgezet om te rijpen, is er toegenomen belangstelling voor een breed scala van weefsel parameters, met inbegrip van weefsel vorm. Manipuleren van weefsel vorm op de micrometer tot centimeter schaal kan direct Celuitlijning, effectieve mechanische eigenschappen wijzigen en beperkingen met betrekking tot de verspreiding van voedingsstoffen te pakken. Daarnaast kan het vaartuig waarop een weefsel is voorbereid mechanische beperkingen op het weefsel, wat resulteert in stress-velden die verder zowel de cel als de matrix structuur beïnvloeden kunnen geven. Gevormde weefsels met zeer reproduceerbaar afmetingen hebben ook utility voor in vitro testen in welke steekproef afmetingen kritisch, zoals hele weefsel mechanische analyse zijn.
Dit manuscript wordt een alternatieve fabricage methode met behulp van negatieve master mallen bereid uit laser geëtst acryl beschreven: deze mallen voeren goed met Polydimethylsiloxaan (PDMS), ontwerpen met afmetingen op de schaal van de centimeter en functie toestaan maten kleiner dan 25 µm, en kunnen snel ontworpen en gefabriceerd tegen lage kosten en met minimale deskundigheid. De minimale tijd en kosten eisen toestaan voor laser geëtst mallen te snel worden herhaald op tot een optimaal ontwerp is vastgesteld en te gemakkelijk aangepast worden aan een kwantitatieve analyse van belang, met inbegrip van die buiten het gebied van weefselengineering.
Introduction
In de afgelopen twee decennia, is zachte litho gebruikt uitgebreid als een fabricage techniek ter ondersteuning van wetenschappelijk onderzoek, met name op het gebied van microfluidics, materiaalonderzoek en weefsel engineering1,2, 3. Replica molding, waarin een object met een gewenste vorm wordt gemaakt van een negatieve master mold, biedt een handige en goedkope methode voor het produceren van positieve dat PDMS repliceert die kan worden gebruikt voor het gieten vormige hydrogels. Echter de vereiste negatieve master mallen zijn meestal geproduceerd met behulp van microfabrication-technieken die zijn duur, tijdrovend, beperkt in omvang, en vereisen cleanroom ruimte en geavanceerde apparatuur. Hoewel 3D printen een mogelijke alternatief biedt, is het nut ervan enigszins beperkt vanwege de beperkte resolutie van goedkopere printers en de chemische interacties tussen gemeenschappelijke 3D printer polymeren en PDMS die genezen remmen kan.
Laser cutter systemen die kunnen zowel knippen en etsen van materialen zoals kunststof, hout, glas en metaal geworden onlangs drastisch minder duur en dus toegankelijker voor het fabriceren van onderzoekgereedschappen. Commerciële grade laser scharen zijn geschikt voor het fabriceren van objecten op de schaal van de centimeter met minimale functies kleiner dan 25 µm, en verder vereist minimale opleiding, expertise en tijd om te gebruiken. Terwijl laser ablatie van PDMS eerder in de fabricage van microfluidics apparaten gebruikt is, om onze kennis heeft geen manuscript beschreven een proces door welke millimeter en centimeter schaal mallen kunnen worden vervaardigd uit laser gesneden negatieve master mallen4 .
We hebben deze techniek hoofdzakelijk gebruikt voor het manipuleren van de vorm van gemodificeerde weefsels ter verbetering van de verspreiding van voedingsstoffen, cellulaire uitlijning en mechanische eigenschappen5,6,7. Echter, kan de veelzijdigheid van deze techniek voor het gebruik op elk gebied waar gegoten hydrogels van belang, zoals drug delivery en materiaal wetenschappelijk onderzoek8 zijn. Met toegang tot een laser cutter, PDMS schimmel wordt gerepliceerd kunnen worden gemaakt voor bijna elk meetkunde zonder overhangen (dat zou verwijderen zonder een meerdelige mal, die buiten het bestek van dit manuscript valt remmen) en die past binnen de afmetingen van de laser-bed.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aangepaste PDMS schimmel geometrieën die compatibel met weefselkweek zijn hebben groot nut bij het afstemmen van belangrijke gemanipuleerde weefsel eigenschappen, zoals de celuitlijning, diffusie tarief en effectieve stijfheid. Deze mallen zijn bovendien zeer nuttig voor het voorbereiden van weefsels voor analyse toepassingen waarin geometrie belangrijk, zoals mechanische testen16,17 is. Voorbereiding van deze apparaten van laser gesneden negatieve master mallen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen financiering van NIH R00 HL115123 en Brown University School of Engineering. Ze zijn ook de bruin Design Workshop en Chris Bull dankbaar voor training en ondersteuning met de laser cutter.
Materials
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
Riferimenti
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491 (2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
