Custom Engineered moldes de cultura de tecidos de Masters gravados a Laser
Summary
Aqui apresentamos um método rápido, fácil e baixo custo para a fabricação de moldes de polidimetilsiloxano personalizado que podem ser usados para a produção de tecidos de engenharia baseada em hidrogel com geometrias complexas. Adicionalmente descrevemos os resultados de avaliações mecânicas e histológicos realizados na engenharia tecidos cardíacos produzidos utilizando esta técnica.
Abstract
Como o campo da engenharia de tecidos tem continuado a amadurecer, tem havido crescente interesse em uma ampla gama de parâmetros de tecido, incluindo a forma de tecido. Manipulando a forma de tecido sobre o micrômetro para escala centímetro pode direcionar o alinhamento da célula, alterar propriedades mecânicas eficazes e resolver limitações relacionadas com a difusão de nutrientes. Além disso, o recipiente em que um tecido é preparado pode transmitir restrições mecânicas no tecido, resultando em campos de stress que mais podem influenciar a estrutura da célula e a matriz. Em forma de tecidos com dimensões altamente reprodutíveis também tem utilidade para ensaios em vitro no qual amostra dimensões são críticos, tais como tecido de toda a análise mecânica.
Este manuscrito descreve um método alternativo de fabricação utilizando moldes mestre negativos, preparados a partir de acrílico gravada a laser: Estes moldes executar bem com polydimethylsiloxane (PDMS), permitem projetos com dimensões na escala de centímetros e recurso tamanhos menores que 25 µm e pode ser rapidamente projetada e fabricada a baixo custo e com experiência mínima. Os requisitos de custo e tempo mínimo permitem moldes gravadas a laser que será rapidamente em cima até um projeto ideal é determinado e ser facilmente adaptadas para se adequar a qualquer ensaio de interesse, incluindo aqueles além do domínio da engenharia de tecidos.
Introduction
Nas últimas duas décadas, litografia macia tem sido amplamente utilizada como uma técnica de fabricação para apoiar a investigação científica, nomeadamente nos domínios da microfluídica, pesquisa de materiais e tecidos engenharia1,2, 3. Moldagem de réplica, na qual um objeto com uma forma desejada é criado a partir de um molde negativo de mestre, oferece um conveniente e de baixo custo método de produzir positivo que PDMS Replica que pode ser usado para fundição em forma de hidrogel. No entanto, os moldes de mestre negativos necessários normalmente são produzidos usando técnicas microfabrication que são caro, demorado, limitado em tamanho, e exigem espaço de sala limpa e equipamentos sofisticados. Enquanto a impressão 3D oferece uma alternativa potencial, sua utilidade é limitada devido aos limites da resolução de impressoras de baixo custo e as interações químicas entre polímeros de impressora 3D comuns e PDMS que pode inibir a polimerização.
Sistemas de cortador laser capaz de corte e gravura materiais tais como plástico, madeira, vidro e metal tornaram-se recentemente drasticamente menos caro e, portanto, mais acessível para a fabricação de ferramentas de pesquisa. Cortadores de laser da classe comercial são capazes de fabricar objetos na escala de centímetros com características mínimas menores que 25 µm e requerem mais treinamento mínimo, conhecimentos e tempo para usar. Enquanto a ablação a laser de PDMS foi anteriormente usada na fabricação de dispositivos de microfluídica, para o nosso conhecimento nenhum manuscrito descreveu um processo pelo qual milímetros e centímetros escala moldes podem ser fabricados de laser cortar moldes mestre negativos4 .
Usamos esta técnica principalmente para manipular a forma dos tecidos projetados para melhorar a difusão de nutrientes, o alinhamento celular e propriedades mecânicas5,6,7. No entanto, a versatilidade desta técnica permite a utilização em qualquer campo onde hidrogel moldados é de interesse, tais como drogas entrega e material ciência pesquisa8. Com acesso a um cortador do laser, PDMS molde repetições podem ser feitas para quase qualquer geometria sem saliências (que iria inibir a remoção sem um molde multi-parte, que está além do escopo deste manuscrito) e que se encaixa dentro das dimensões da cama do laser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geometrias de molde PDMS personalizadas que são compatíveis com a cultura de tecidos tem grande utilidade na afinação Propriedades importante tecido de engenharia, tais como o alinhamento da célula, taxa de difusão e rigidez eficaz. Além disso, estes moldes são muito úteis para a preparação de tecidos para aplicações de análise em que a geometria é importante, como mecânico teste16,17. Preparar estes dispositivos de laser corta moldes mestre negat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem que o financiamento do NIH R00 HL115123 e Brown University School of Engineering. Eles também são gratos ao Brown Design Workshop e Chris Bull para treinamento e suportam com o cortador do laser.
Materials
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
Riferimenti
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491 (2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
