Coutume machinée moules de vitroplants de maîtres gravé au Laser
Summary
Ici, nous présentons une méthode rapide, facile et peu coûteux de fabriquer des moules de polydiméthylsiloxane personnalisé qui peuvent être utilisés pour la production de tissus conçus à base hydrogel avec des géométries complexes. En outre, nous décrivons les résultats d’évaluations histologiques et mécaniques effectuées sur des tissus cardiaques machinés produites à l’aide de cette technique.
Abstract
Comme le domaine de l’ingénierie tissulaire a continué d’évoluer, il y a eu un intérêt accru dans un large éventail de paramètres de tissus, y compris la forme du tissu. Manipulation forme le tissu sur le micromètre à l’échelle du centimètre peut diriger l’alignement de la cellule, modifier les propriétés mécaniques efficaces et pallier les lacunes liées à la diffusion des éléments nutritifs. En outre, le bateau dans lequel est disposé un tissu peut donner des contraintes mécaniques sur les tissus, résultant dans des champs de contraintes qui peuvent influencer davantage la structure de la cellule et la matrice. Les tissus façonnés avec des dimensions très reproductibles ont aussi utilitaire pour des dosages in vitro dans quel échantillon dimensions sont critiques, telles que l’analyse mécanique des tissus ensemble.
Ce manuscrit décrit un procédé de fabrication alternatives utilisant des moules maîtres négatifs préparées à partir d’acrylique gravé au laser : ces moules effectuer bien avec polydiméthylsiloxane (PDMS), permettent des dessins avec des dimensions sur l’échelle de centimètre et la fonctionnalité tailles plus petit que 25 µm et peuvent être rapidement conçu et fabriqué à moindre coût et connaissant un minimum. Le minimum de temps et les dépenses permettant gravé au laser moules rapidement itération sur jusqu’à ce qu’une conception optimale est déterminée et être facilement adaptées pour convenir à n’importe quel test d’intérêt, y compris celles au-delà du domaine de l’ingénierie tissulaire.
Introduction
Pendant les deux dernières décennies, lithographie douce a été largement utilisé comme une technique de fabrication pour soutenir la recherche scientifique, notamment dans les domaines de la microfluidique, recherche sur les matériaux et tissus techniques1,,2, 3. Moulage de réplique, dans laquelle un objet avec une forme désirée est créé un moule négatif de maître, vous propose une méthode commode et peu coûteux de produire positive que PDMS réplique qui peut être utilisée pour la coulée en forme hydrogels. Toutefois, les moules de maîtres négatifs requis sont généralement produites à l’aide de techniques de microfabrication qui sont coûteux, chronophages, limitées en taille, et exigent l’espace chambre propre et un équipement sophistiqué. Alors que l’impression 3D offre une alternative potentielle, son utilité est quelque peu limitée en raison des limites de résolution des imprimantes de bas-coût et les interactions chimiques entre les polymères imprimante 3D courants et PDMS qui peuvent inhiber la polymérisation.
Systèmes de coupe laser capable de découpe et de gravure de matériaux comme le plastique, bois, verre et métal sont récemment devenus radicalement moins cher et donc plus accessibles pour la fabrication d’outils de recherche. Coupeurs de laser de qualité commerciale sont capables de fabriquer des objets à l’échelle du centimètre avec les caractéristiques minimales inférieures à 25 µm et plus besoin d’un minimum de formation, d’expertise et temps d’utiliser. Alors que l’ablation par laser de PDMS a été précédemment utilisé dans la fabrication des dispositifs microfluidiques, à notre connaissance, aucun manuscrit n’a décrit un processus par lequel millimètres et un centimètre échelle moules peuvent être fabriqués de moules maîtres négatifs4 de découpées au laser .
Nous avons utilisé cette technique principalement pour manipuler la forme des tissus techniques afin d’améliorer la diffusion des éléments nutritifs, l’alignement cellulaire et propriétés mécaniques5,6,7. Toutefois, la polyvalence de cette technique permet pour une utilisation dans tous les domaines où les hydrogels moulés sont d’intérêt, comme drogue livraison et matériel scientifique recherche8. Accès à un coupeur de laser, PDMS moule répétitions peuvent être faites pour presque n’importe quelle géométrie sans porte-à-faux (qui inhiberaient le retrait sans un moule multi-part, qui déborde le cadre de ce manuscrit) et qui s’inscrit dans les dimensions du lit laser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des géométries de moule PDMS personnalisés qui sont compatibles avec la culture de tissu ont grande utilité dans le réglage des propriétés de l’important tissu machiné, tels que l’alignement de la cellule, le taux de diffusion et rigidité effective. En outre, ces moules sont très utiles pour la préparation des tissus pour des applications d’analyse où la géométrie est importante, tels que mécanique test16,17. Préparer ces dispositifs laser c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient financement du NIH R00 HL115123 et Brown University School of Engineering. Ils sont également reconnaissants à l’atelier de création de Brown et Chris Bull pour la formation et de soutiennent avec la coupe au laser.
Materials
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
Riferimenti
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491 (2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
