Abitudine costruita stampi di coltura del tessuto da maestri inciso al Laser
Summary
Qui presentiamo un metodo rapido, facile e a basso costo per la realizzazione di stampi di polidimetilsilossano personalizzato che possono essere utilizzati per la produzione di tessuti ingegnerizzati a base di idrogel con geometrie complesse. Descriviamo inoltre risultati dalle valutazioni meccaniche ed istologiche condotte su tessuti cardiaci ingegnerizzati prodotti utilizzando questa tecnica.
Abstract
Come il campo dell’ingegneria tissutale ha continuato a maturare, ci è stato interesse aumentato in una vasta gamma di parametri di tessuto, compresi la forma del tessuto. Manipolazione del tessuto forma sul micrometro per centimetro scala può dirigere l’allineamento di cella, alterare efficace proprietà meccaniche e indirizzo limitazioni legate alla diffusione dei nutrienti. Inoltre, il recipiente in cui viene preparato un tessuto può impartire vincoli meccanici sul tessuto, con conseguente campi di stress che possono influire ulteriormente sulla struttura della cellula e la matrice. Tessuti a forma con dimensioni altamente riproducibili hanno anche utilità per saggi in vitro nel quale campione dimensioni sono fondamentali, quali l’analisi meccanica del tessuto intero.
Questo manoscritto descrive un metodo di fabbricazione alternativi che utilizzano stampi master negativi preparati da acrilico inciso a laser: questi stampi eseguire bene con polidimetilsilossano (PDMS), per consentire di disegni con dimensioni sulla scala di centimetro e funzionalità taglie più piccolo di 25 µm e può essere rapidamente progettati e fabbricati a basso costo e con minimo grado di esperienza. Il tempo minimo e requisiti di costo consentono stampi incise al laser per essere rapidamente iterato su finché non viene determinato un design ottimale e per essere facilmente adattata a qualsiasi test di interesse, tra cui quelli oltre il campo dell’ingegneria tissutale.
Introduction
Durante le due decadi scorse, litografia soft è stato usato estesamente come una tecnica di fabbricazione per sostenere la ricerca scientifica, in particolare nei settori della microfluidica, ricerca dei materiali e dei tessuti ingegneria1,2, 3. Stampaggio di replica, in cui viene creato un oggetto con una forma desiderata da uno stampo negativo master, offre un metodo conveniente e a basso costo di produrre positivo che PDMS replica che può essere utilizzato per la colata a forma di idrogeli. Tuttavia, gli stampi master negativi richiesti sono in genere prodotte con tecniche di microfabbricazione che sono costosi, che richiede tempo, limitato nelle dimensioni, e richiedono spazio camera pulita e sofisticate attrezzature. Mentre stampa 3D offre un’alternativa potenziale, la sua utilità è alquanto limitata a causa dei limiti di risoluzione di stampanti a basso costo e le interazioni chimiche tra comune stampante 3D polimeri e PDMS che possono inibire la polimerizzazione.
Sistemi di taglio laser capace di taglio e incisione di materiali come plastica, legno, vetro e metallo sono di recente diventati drasticamente meno costosi e quindi più accessibile per la realizzazione di strumenti di ricerca. Taglio laser in grado commerciale è in grado di fabbricare oggetti sulla bilancia centimetro con requisiti minimi inferiori a 25 µm e richiede ulteriore formazione minima, esperienza e tempo di utilizzo. Mentre l’ablazione laser di PDMS è stato precedentemente utilizzato nella fabbricazione di dispositivi microfluidici, a nostra conoscenza nessun manoscritto ha descritto un processo da cui millimetri e un centimetro scala stampi possono essere fabbricate da stampi negativi master4 a taglio laser .
Noi abbiamo utilizzato questa tecnica principalmente per manipolare la forma di tessuti ingegnerizzati al fine di migliorare la diffusione dei nutrienti, allineamento cellulare e proprietà meccaniche5,6,7. Tuttavia, versatilità di questa tecnica consente l’utilizzo in qualsiasi campo dove modellati idrogeli sono di interesse, come droga consegna e materiale scienza ricerca8. Con accesso a una taglierina laser, PDMS stampo replicati possono essere fatte per quasi qualsiasi geometria senza sporgenze (che avrebbe inibito la rimozione senza una muffa multiparte, che esula dall’ambito di questo manoscritto) e che si inserisce all’interno delle dimensioni del letto laser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geometrie di stampo PDMS personalizzate che sono compatibili con la coltura del tessuto hanno grande utilità nella sintonizzazione proprietà importante tessuto ingegnerizzato, quali l’allineamento di cella, tasso di diffusione e la rigidezza efficace. Inoltre, questi stampi sono molto utili per la preparazione di tessuti per applicazioni di analisi in cui geometria è importante, come meccanico test16,17. Preparare questi dispositivi dal laser taglio negativo s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono finanziamenti dal NIH R00 HL115123 e Brown University School of Engineering. Sono anche grati per il Workshop di progettazione di Brown e Chris Bull per formazione e supporto con la taglierina del laser.
Materials
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
Riferimenti
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