我们描述了一个详细的协议, 为 Lambda 选择cII突变试验的培养细胞的转基因啮齿动物或相应的动物处理的化学/物理剂的利益。该方法已广泛用于哺乳动物细胞致癌物质的诱变检测。
开发了多种转基因动物模型和突变检测系统, 用于哺乳动物细胞致癌物质的诱变检测。其中, 转基因小鼠和 Lambda (λ) 选择cII突变检测系统已被全球许多研究团体用于致突变实验。在这里, 我们描述了 Lambda 选择cII突变检测的详细协议, 该方法可应用于转基因小鼠/大鼠的培养细胞或与化学/物理制剂相关的动物。该协议包括以下步骤: (1) 从转基因动物的细胞或器官/组织中分离出基因组 DNA, 分别处理体外或体内, 并用一个测试化合物;(2) 从基因组 DNA 中回收携带突变报告基因 (即、 cII转基因) 的 lambda 梭载体;(3) 将获救的载体包装成传染性噬菌体;(4) 感染宿主细菌并在选择性条件下培养, 以允许传播诱导的cII突变;(5) 评分的cII突变体和 DNA 序列分析, 以确定cII突变频率和变异谱, 分别。
开发了多种转基因动物模型和突变检测系统, 用于哺乳动物细胞致癌物质的诱变检测。其中, 转基因大蓝 (简称 BB) 小鼠和λ选择cII突变检测系统是由该组和许多其他研究组在世界范围内的致突变实验所使用的1,2, 3,4,5,6,7,8,9。在过去的16年中, 我们研究了各种化学和/或物理剂的诱变效应, 这些转基因动物或其相应的胚胎成纤维细胞培养的试验化合物处理, 并随后分析了cII转基因的表型和基因型由λ选择cII化验和 DNA 测序, 分别为10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. 这些转基因动物的基因组含有噬菌体λ梭向量 (λLIZ), 它集成在4号染色体上, 作为多拷贝头到尾 concatemer1,2,25。λLIZ 梭向量携带两个突变的报告基因, 即lacI和cII转基因1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47. λ选择cII检测是基于从转基因动物器官/组织的细胞基因组 DNA 中恢复λLIZ 梭向量的方法1,2,25.回收的λLIZ 梭载体然后被包装成λ噬菌体头, 能够感染指标宿主大肠杆菌. 随后, 受感染的细菌在选择性条件下生长, 以便在cII转基因1、3中对突变进行评分和分析。
在这里, 我们描述了λ选择cII分析的详细协议, 该方法包括从转基因动物细胞/器官中分离出的基因组 DNA, 从体外处理体内/与一个测试化合物, 检索λLIZ 梭向量从基因组 DNA, 载体的包装到传染性的λ噬菌体, 感染的宿主大肠杆菌与噬菌体, 鉴定的cII突变体在选择性条件下确定cII突变频率, 并DNA 序列分析建立了cII突变谱。该协议可应用于转基因鼠/大鼠细胞培养处理体外与化学/物理剂的兴趣, 或组织/器官的相应动物处理体内与测试化学/代理1, 2,4,48,49,50,51,52。λ选择cII分析的示意图演示显示在图 1中。
λ选择cII检测用于检测从 BB 啮齿动物的器官/组织中提取的细胞基因组 DNA 中回收的cII转基因中的突变 (3)。这些转基因动物的基因组包含多个串联拷贝的染色体集成λLIZ 穿梭载体, 运载cII (294 bp) 和lacI (1080 bp) 转基因, 作为突变的报告基因1,2,25. λ选择cII检测的基础是从转基因动?…
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢所有同事和合作者对我们最初的研究所作的贡献, 这份手稿中的结果已经在本稿中提到 (为了说明目的)。作者的工作得到了国家卫生研究院牙科和颅面研究研究所 (1R01DE026043) 和加州大学烟草相关疾病研究计划 (ab) 的资助 (TRDRP-26IR-0015) 和 ST (TRDRP-25IP-0001)。研究的发起者在研究设计、数据收集、数据分析、数据解释、报告撰写或提交出版物的决定中都没有作用。
Agar | MO Bio Laboratories, Inc. | 12112-05 | Bacteriological grade |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific | 4337455 | None |
Casein Peptone | Alfa Aesar | H26557 | None |
Gelatine | J. T. Baker | 2124-01 | Powder |
Glycerol | Fisher Scientific | BP 229-1 / M-13750 | None |
LB Agar | Fisher Scientific | BP 9724-500 | None |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 8104 | 50 PCR purification reactions |
Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | M-15756 | None |
Taq5000 DNA Polymerase | Qiagen | 201207 | None |
Thiamine Hydrochloride | Macron Fine Chemicals | 2722-57 | None |
Transpack Packaging Extract | Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. | 200223 | 50 packaging reactions |
Tris Base | Fisher Scientific | BP 152-1 / EC 201-064-4 | None |
Trypton | Biosciences | RC-110 | None |