Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de Lambda Selecteer cII mutatie assay in gekweekte cellen van transgene knaagdieren of de overeenkomstige dieren behandeld met een chemische/fysieke agent van belang. Deze aanpak heeft wijd gebruikt voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen.
Een aantal transgene diermodellen en mutatie detectiesystemen zijn ontwikkeld voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen. Van deze zijn transgene muizen en de Lambda (λ) Selecteer cII mutatie detectiesysteem tewerkgesteld voor mutageniteit experimenten door veel onderzoeksgroepen wereldwijd. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de Lambda Selecteer cII mutatie assay, die kan worden toegepast op gekweekte cellen van transgene muizen/ratten of de overeenkomstige dieren behandeld met een chemische/fysieke agent van belang. Het protocol bestaat uit de volgende stappen: (1) isolatie van genomic DNA van de cellen of organen/weefsels van transgene dieren behandeld in vitro of in vivo, respectievelijk een teststof; (2) herstel van de lambda shuttle vector uitvoering een vogelgriepvirus verslaggever-gen (dat wil zeggen, cII transgenic) uit de genomic DNA; (3) de verpakking van de geredde vectoren in infectieuze bacteriofagen; (4) een host bacteriën infecteren en kweken in selectieve omstandigheden dat verspreiding van de geïnduceerde cII mutaties; en (5) scoren de cII-mutanten en DNA-sequentie analyse om te bepalen van de cII mutantfrequentie en mutatie spectrum, respectievelijk.
Een breed scala van transgene diermodellen en mutatie detectiesystemen zijn ontwikkeld voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen. Van deze hebben transgene muizen van de Big Blue (genoemd hierna BB) en de λ Select cII mutatie detectiesysteem gewerkt voor mutageniteit experimenten door deze groep en vele andere onderzoek groepen wereldwijd1,2, 3,4,5,6,7,8,9. Voor de afgelopen 16 jaar, hebben we onderzocht de mutagene effecten van verschillende chemische en/of fysische agentia met behulp van deze transgene dieren of hun overeenkomstige embryonale fibroblast celculturen behandeld met een teststof en vervolgens geanalyseerd de fenotype en genotype van de cII transgenic door de λ Select cII assay en DNA sequencing, respectievelijk10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. het genoom van deze transgene dieren bevat een bacteriofaag lambda shuttle vector (λLIZ) geïntegreerd op chromosoom 4 als een multicopy hoofd-tot-staart concatemer1,2,25. De vector λLIZ shuttle draagt twee vogelgriepvirus reporter genen, namelijk de lacI en cII transgenen1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. de λ Select cII bepaling is gebaseerd op het herstel van de λLIZ shuttle vectoren van de genomic DNA van cellen afgeleid van organen/weefsels van transgene dieren1,2,25 . De herstelde λLIZ shuttle vectoren worden vervolgens verpakt in lambda phage hoofden kunnen infecteren een indicator host Escherichia coli. Vervolgens worden de geïnfecteerde bacteriën gekweekt in selectieve omstandigheden kunnen scoren en analyse van mutaties in de cII transgenic1,3.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de λ Select cII assay, die uit de isolatie van genomic DNA uit cellen/organen van transgene dieren behandeld in vitro bestaat/in vivo met een samengestelde, ophalen van de test van de λLIZ shuttle vectoren van de genomic DNA, verpakking van de vectoren in infectieuze λ bacteriofagen, infectie van de gastheer E. coli met de bacteriofagen, identificatie van de cII-mutanten in selectieve omstandigheden om te bepalen van de mutantfrequentie cII , en DNA sequentieanalyse ervoor zorgen dat het spectrum van de mutatie cII . Het protocol kan worden toegepast op transgene muis/rat cel culturen behandeld in vitro met een chemische/fysieke agent van belang, of weefsels/organen van de overeenkomstige dieren behandeld in vivo met de test chemische/agent1, 2,4,48,49,50,51,52. Een schematische voorstelling van de λ Select cII assay is afgebeeld in Figuur 1.
De λ Select cII bepaling wordt gebruikt voor de detectie van mutaties in de cII transgenic verhaald aan de genomic DNA van cellen uit organen/weefsels van BB knaagdieren3verkregen. Het genoom van deze transgene dieren bevat meerdere exemplaren van de tandem van de shuttle-vector inplanten geïntegreerde λLIZ, die de cII draagt (294 bp) en lacI (1.080 bp) transgenen, als het vogelgriepvirus reporter genen1, 2…
The authors have nothing to disclose.
Wij willen erkennen van de bijdragen van alle collega’s en medewerkers aan onze oorspronkelijke studies, waarvan de resultaten naar zijn verwezen in dit manuscript (ter illustratie). De auteurs werk wordt ondersteund door subsidies van het nationale Instituut van tand- en craniofaciale onderzoek van de National Institutes of Health (1R01DE026043) aan AB en aan de University of California Tobacco-Related Disease Research Program aan AB) TRDRP-26IR-0015) en de ST (TRDRP-25IP-0001). De sponsors van de studie had geen rol in de studie ontwerp, dataverzameling, data-analyse, data interpretatie, schrijven van het verslag, of in het besluit tot het indienen voor publicatie.
Agar | MO Bio Laboratories, Inc. | 12112-05 | Bacteriological grade |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific | 4337455 | None |
Casein Peptone | Alfa Aesar | H26557 | None |
Gelatine | J. T. Baker | 2124-01 | Powder |
Glycerol | Fisher Scientific | BP 229-1 / M-13750 | None |
LB Agar | Fisher Scientific | BP 9724-500 | None |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 8104 | 50 PCR purification reactions |
Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | M-15756 | None |
Taq5000 DNA Polymerase | Qiagen | 201207 | None |
Thiamine Hydrochloride | Macron Fine Chemicals | 2722-57 | None |
Transpack Packaging Extract | Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. | 200223 | 50 packaging reactions |
Tris Base | Fisher Scientific | BP 152-1 / EC 201-064-4 | None |
Trypton | Biosciences | RC-110 | None |