JoVE Journal > Immunology and Infection
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Immunologia e infezioni

Die Lambda wählen Sie cII Mutation-Detection-System

Published: April 26, 2018
doi:
10.3791/57510
,
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine,University of Southern California

Summary

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für Lambda wählen Sie cII Mutation Assay in kultivierten Zellen von transgenen Nagetiere oder die entsprechenden Tiere behandelt mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse. Dieser Ansatz hat verbreitet zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen.

Abstract

Eine Reihe von transgene Tiermodelle und Mutation-Detection-Systeme wurden zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen entwickelt. Von diesen sind Transgene Mäuse und Lambda (λ) Select cII Mutation Detection System für Mutagenität Experimente von vielen Forschergruppen weltweit eingesetzt worden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Lambda wählen Sie cII Mutation Assay, die kultivierten Zellen von transgenen Mäusen/Ratten angewendet werden können oder die entsprechenden Tiere behandelt mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse. Das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: (1) Isolierung genomischer DNA aus den Zellen oder Organe/Gewebe von transgenen Tieren behandelt in Vitro oder in Vivo, jeweils mit einer Testverbindung; (2) Wiederherstellung des Lambda-Shuttle Vektors mit mutagenen Reportergen (d.h. cII Transgen) aus genomischer DNA; (3) Verpackung der geretteten Vektoren in infektiösen Bakteriophagen; (4) ein Host-Bakterium infizieren und Kultivierung unter selektiven Bedingungen zur Vermehrung der induzierten cII Mutationen erlauben; und (5) Bewertung der cII-Mutanten und DNA-Sequenz-Analyse zur Ermittlung der Mutantenhäufigkeit cII und Mutation Spektrum bzw..

Introduction

Eine Vielzahl von transgene Tiermodelle und Mutation-Detection-Systeme wurden zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen entwickelt. Von diesen sind Transgene Mäuse Big Blue (im folgenden als BB bezeichnet) und λ Select cII Mutation Detection System von dieser Gruppe und viele andere Forschung Gruppen weltweit1,2für Mutagenität Experimente eingesetzt worden, 3,4,5,6,7,8,9. Für den vergangenen 16 Jahren haben wir die mutagenen Wirkungen von verschiedenen chemischen und/oder physikalischen Agents verwenden diese transgenen Tieren untersucht oder ihre entsprechenden embryonalen Fibroblasten Zellkulturen mit einer Testverbindung behandelt und anschließend analysiert die Phänotyp und Genotyp des Transgens cII von λ Select cII Assay und DNA-Sequenzierung, bzw.10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. das Genom dieser transgenen Tiere enthält einen Bakteriophagen λ Shuttle Vektor (λLIZ) auf Chromosom 4 als ein Multi-Kopie Head-to-Tail Concatemer1,2,25integriert. ΛLIZ Shuttle Vektor enthält zwei mutagenen Reporter Gene, nämlich der LacI und cII transgene1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ Select cII Assay basiert auf der Wiederherstellung der λLIZ Shuttle-Vektoren aus genomischer DNA von Zellen aus Organe/Gewebe von transgenen Tieren1,2,25 . Die wiederhergestellten λLIZ Shuttle-Vektoren werden dann in λ-Phagen-Köpfe in der Lage, einen Indikator Host Escherichia coliInfektion verpackt. Anschließend werden die infizierten Bakterien unter selektiven Bedingungen zu ermöglichen, Bewertung und Analyse von Mutationen in der cII Transgen1,3angebaut.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für λ Select cII Assay, bestehend aus der Isolierung der genomischen DNA von den Zellen/Organen der transgenen Tiere behandelt in Vitro/in Vivo mit einem Test Verbindung, Abruf von der λLIZ shuttle-Vektoren aus der genomischen DNA Verpacken der Vektoren in infektiösen λ-Phagen, Infektion des Wirts E. Coli mit Bakteriophagen, Identifikation von cII-Mutanten unter selektiven Bedingungen der cII Mutantenhäufigkeit bestimmen und DNA-Sequenzanalysen, die cII -Mutation-Spektrum zu etablieren. Das Protokoll kann auch auf transgenen Maus/Ratte Zelle Kulturen behandelt in Vitro mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse oder Gewebe/Organe der entsprechenden Tiere behandelt in Vivo mit dem Test chemische/Agent1, 2,4,48,49,50,51,52. Eine schematische Darstellung des λ-Select cII -Assays ist in Abbildung 1dargestellt.

Protocol

1. genomischer DNA-Isolierung aus embryonalen Fibroblasten der Maus Hinweis: Primäre Maustaste embryonalen Fibroblasten sind nach den veröffentlichten Protokoll53von Embryonen abgeleitet von BB transgenen Mäusen C57BL/6 genetischen hintergrund isoliert. Das Ausgangsmaterial für dieses Protokoll besteht aus 1 x 106 bis 1 x 107 embryonalen fibroblastenzellen mit einem Test zusammengesetzte versus Kontrolle behandelt. Die Ernte und die Zäh…

Representative Results

Je nach Verteilung der Daten werden parametrische oder nicht-parametrische Tests verwendet, um die Bedeutung der Unterschied in der Mutantenhäufigkeit cII zwischen Behandlung und Kontrollgruppen (d. h.im Vergleich zu spontanen mutierten Frequenzen induziert) bestimmen . Vergleich der induzierten cII mutierten Frequenzen in ganz verschiedenen Behandlungsgruppen erfolgt durch verschiedene (paarweise) statistische Tests, soweit anwendbar. Hypergeometrische Test vo…

Discussion

Der λ-Select cII -Test dient zum Nachweis von Mutationen in der cII -Transgen erholt aus genomischer DNA von Zellen aus Organe/Gewebe von BB Nagetiere3. Das Genom dieser transgenen Tiere enthält mehrere Tandem Kopien der chromosomal integrierte λLIZ Shuttle-Vektor, der die cII trägt (294 bp) und LacI (1.080 bp) transgene, als die Mutationszucht Reporter Gene1, 2 , 25</sup…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir würden gerne die Beiträge aller Kollegen und Mitarbeiter zu unserer ursprünglichen Studien, deren Ergebnisse in diesem Manuskript (zur Veranschaulichung) erwähnten anerkennen. Arbeit der Autoren wird unterstützt durch Zuschüsse aus dem nationalen Institut für zahnärztliche und Craniofacial Forschung von den National Institutes of Health (1R01DE026043), AB und an der University of California Tobacco-Related Krankheit Forschungsprogramm, das AB ( TRDRP-26IR-0015) und ST (TRDRP-25IP-0001). Die Sponsoren der Studie hatte keine Rolle im Studiendesign, Datenerhebung, Datenanalyse, Datenauswertung, Schreiben des Berichts oder in der Entscheidung zur Veröffentlichung einreichen.

Materials

Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None
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Besaratinia, A., Tommasi, S. The Lambda Select cII Mutation Detection System. J. Vis. Exp. (134), e57510, doi:10.3791/57510 (2018).
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