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Immunologia e infezioni

La Lambda seleccione cII sistema de detección de mutación

Published: April 26, 2018
doi:
10.3791/57510
,
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine,University of Southern California

Summary

Se describe un protocolo detallado para el ensayo de mutación Lambda seleccione cII en cultivos de células de roedores transgénicos o los correspondientes animales tratados con un agente químico físico de interés. Este enfoque ha sido ampliamente utilizado para las pruebas de mutagenicidad de agentes carcinógenos en células de mamíferos.

Abstract

Un número de modelos animales transgénicos y sistemas de detección de mutación ha sido desarrollado para las pruebas de mutagenicidad de agentes carcinógenos en células de mamíferos. De estos ratones transgénicos y el Lambda (λ) Seleccione cII sistema de detección de mutación han sido utilizados para experimentos de mutagenesis por muchos grupos de investigación en todo el mundo. Aquí, describimos un protocolo detallado para el ensayo de mutación de cII en seleccionar Lambda, que se puede aplicar a cultivos de células de ratones/ratas transgénicas o los correspondientes animales tratados con un agente químico físico de interés. El protocolo consta de los siguientes pasos: (1) aislamiento de ADN genómico de las células o los órganos/tejidos de los animales transgénicos trataron en vitro o en vivo, respectivamente, con un compuesto de prueba; (2) recuperación del vector lanzadera lambda lleva un gen reportero mutacional (es decir, transgén cII ) de la DNA genómico; (3) envases de los vectores rescatados en bacteriófagos infecciosos; (4) que infecta a una bacteria huésped y cultivo selectivo condiciones para permitir la propagación de las mutaciones inducidas cII ; y (5) anotar la cII-mutantes y ADN la secuencia de análisis para determinar la frecuencia de mutantes cII y el espectro de la mutación, respectivamente.

Introduction

Una amplia gama de modelos de animales transgénicos y sistemas de detección de mutación se han desarrollado para las pruebas de mutagenicidad de agentes carcinógenos en células de mamíferos. De estos ratones transgénicos Big Blue (denominado en adelante BB) y λ Select cII sistema de detección de mutación han sido empleados para experimentos de mutagenesis por este grupo y muchos otros investigación grupos en todo el mundo1,2, 3,4,5,6,7,8,9. Durante los últimos 16 años, hemos investigado los efectos mutagénicos de diversos agentes químicos o físicos con estos animales transgénicos o sus correspondientes cultivos celulares de fibroblastos embrionarios trataron con un compuesto de prueba y posteriormente analizaron el fenotipo y genotipo del transgén cII por el λ Select cII análisis y secuenciación de ADN, respectivamente10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. el genoma de estos animales transgénicos contiene bacteriófago λ transporte vector (λLIZ) integrado en el cromosoma 4 como un concatemer de cabeza a la cola de copia múltiple1,2,25. El vector de la lanzadera λLIZ lleva dos genes del reportero mutacional, es decir, el lacI y cII los transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. el ensayo Select cII λ se basa en la recuperación de los vectores de transporte λLIZ de ADN genómico de células derivadas de órganos/tejidos de animales transgénicos1,2,25 . Los vectores de transporte λLIZ recuperado luego se empaquetan en cabezas de fago λ capaces de infectar a un huésped indicador Escherichia coli. Posteriormente, se cultivan las bacterias infectadas bajo condiciones selectivo para permitir puntuación y análisis de mutaciones en el cII transgen1,3.

Aquí, describimos un protocolo detallado para el ensayo de selección cII λ, que consiste en el aislamiento de ADN genómico de células/órganos de animales transgénicos tratados en vitro/en vivo con una prueba compuesta, recuperación de la λLIZ traslados de vectores de la DNA genomic, empaquetado de los vectores en fagos λ infecciosa, infección del huésped e. coli con los bacteriófagos, identificación de la cII-mutantes en condiciones selectivas para determinar la frecuencia de mutantes de cII , y Análisis de la secuencia de ADN para establecer el espectro de mutación de la cII . El protocolo se puede aplicar a rata Ratón transgénico de la célula las culturas tratados en vitro con un agente químico físico de interés, o tratado de los tejidos/órganos de los animales correspondientes en vivo con el test químico/agente1, 2,4,48,49,50,51,52. Una presentación esquemática de la prueba de selección cII λ se muestra en la figura 1.

Protocol

1. genómica ADN aislado de fibroblastos embrionarios de ratón Nota: Los fibroblastos embrionarios de ratón primario son aislados de embriones derivados de ratones transgénicos de BB con fondo genético C57BL/6, según el protocolo publicado53. El material de partida de este protocolo consiste en 1 x 106 a 1 x 107 células de fibroblasto embrionario tratadas con un test compuesto versus control. La recolección y recuento de estas célula…

Representative Results

Dependiendo de la distribución de los datos, se utilizan pruebas paramétricas o no paramétricas para determinar la significancia de la diferencia en la frecuencia de mutantes cII entre los grupos tratamiento y control (es decir, inducido versus frecuencias de mutante espontáneas) . Comparación de las frecuencias de mutante inducida por cII en los grupos de tratamiento diferentes es hecha por varios (pares) pruebas estadísticas, según sea el caso. La prueb…

Discussion

El ensayo Select cII λ se utiliza para la detección de mutaciones en el transgén de la cII de ADN genómico de células derivadas de órganos/tejidos de roedores de BB3. El genoma de estos animales transgénicos contiene múltiples copias de tándem del vector lanzadera λLIZ cromosómico integrado, que lleva la cII (294 bp) y lacI (1.080 bp) los transgenes, como el reportero mutacional de genes1, 2 <…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría reconocer la contribución de todos los colegas y colaboradores para nuestros estudios originales, cuyos resultados se han descrito en este manuscrito (con fines ilustrativos). Trabajo de los autores es apoyado por becas del Instituto Nacional de odontología e investigación craneofacial de los institutos nacionales de salud (1R01DE026043) AB y de la Universidad de California Tobacco-Related programa de investigación de la enfermedad para () AB TRDRP-26IR-0015) y ST (TRDRP-25IP-0001). Los patrocinadores del estudio no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos, análisis de datos, interpretación de datos, escritura del informe, o en la decisión de enviar para su publicación.

Materials

Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None
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Besaratinia, A., Tommasi, S. The Lambda Select cII Mutation Detection System. J. Vis. Exp. (134), e57510, doi:10.3791/57510 (2018).
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