Identificatie van merkers van de virulentie van Mycobacterium abscessus voor intracellulaire replicatie in fagocyten
Summary
Hier presenteren we twee protocollen om te studeren fagocytensysteem –Mycobacterium abscessus interacties: de screening van een transposon mutant bibliotheek voor bacteriële intracellulaire deficiëntie en de gehaltebepaling van bacteriële intracellulaire transcriptome van RNA sequencing. Beide benaderingen inzicht geven in de genomische voordelen en aanpassingen van de transcriptomic verbetering van intracellulaire bacteriën fitness.
Abstract
Wat Mycobacterium abscessus onderscheidt van andere saprofytische mycobacteriën is de mogelijkheid om te weerstaan fagocytose door menselijke macrofagen en de mogelijkheid om zich te vermenigvuldigen in dergelijke cellen. Deze eigenschappen virulentie renderen M. abscessus pathogene, vooral in kwetsbare hosts met onderliggende structurele longziekten, zoals mucoviscidose, Bronchiëctasie of tuberculose. Het blijft onduidelijk hoe patiënten besmet raken met M. abscessus . In tegenstelling tot vele mycobacteriën, M. abscessus is niet gevonden in de omgeving maar misschien wonen binnen amoeben, milieu fagocyten die een potentieel reservoir voor M. abscessus vertegenwoordigen. Inderdaad, M. abscessus is resistent tegen amoebal fagocytose en de intra-amoeba leven lijkt te verhogen van M. abscessus virulentie in een experimenteel model van infectie. Nochtans, is weinig bekend over de virulentie van de M. abscessus op zich. Om te ontcijferen van de toekenning van een voordeel tot M. abscessus intracellulaire leven genen, werd een screening van een M. abscessus transposon mutant bibliotheek ontwikkeld. Daarnaast is een methode van RNA extractie van intracellulaire mycobacteriën na co cultuur met amoeben werd ontwikkeld. Deze methode was gevalideerd en stond de sequencing van hele M. abscessus transcriptomes binnen de cellen; verstrekken, voor de eerste keer, een globale visie op M. abscessus aanpassing aan intracellulaire leven. Beide benaderingen geven ons inzicht in de M. abscessus virulentiefactoren waarmee M. abscessus te koloniseren de luchtwegen bij de mens.
Introduction
Het genus Mycobacterium bevat soorten variërend van onschadelijk saprofytische organismen tot grote menselijke pathogenen. Bekende pathogene soorten zoals Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum en Mycobacterium ulcerans behoren tot de deelgroep van langzaam groeiende mycobacteriën (SGM). In contrast, de deelgroep van de snel groeiende mycobacteriën (RGM) wordt gekenmerkt door hun vermogen om te vormen van zichtbare kolonies in minder dan 7 dagen op de drager van de agar. De RGM groep bestaat uit meer dan 180 soorten, vooral niet-pathogene saprofytische mycobacteriën. Studies over RGM interacties met hun hosts hebben vooral geconcentreerd op Mycobacterium smegmatis en aantonen dat deze mycobacteriën worden snel geëlimineerd door de bactericide werking van macrofagen.
Mycobacterium abscessus behoort tot de zeldzame RGM die zijn pathogeen voor de mens en is verantwoordelijk voor een groot aantal infecties, variërend van de huid en weke delen infecties aan de longen en gedissemineerde infecties. M. abscessus wordt beschouwd als, samen met Mycobacterium avium, de belangrijkste mycobacteriële pathogen in cystic fibrosis patiënten1.
Diverse studies uitgevoerd op M. abscessus blijkt dat deze mycobacterium gedraagt zich als een intracellulaire pathogenen, staat overleven de bactericide reactie van macrofagen en fibroblasten in de longen en de huid, die meestal niet wordt nageleefd in RGM 2 , 3 , 4. de analyse van het genoom van de M. abscessus heeft geïdentificeerd stofwisselingsroutes meestal gevonden in milieu micro-organismen in contact met de bodem, planten en aquatische milieus, waar gratis amoeben vaak zijn presenteren5. Ze hebben ook aangetoond dat M. abscessus is begiftigd met verschillende virulentiegenen niet gevonden in de saprofytische en niet-pathogene RGM, waarschijnlijk overgenomen door de horizontale genoverdracht in een niche gunstig voor genetische uitwisseling die zou verzamelen verschillende amoeba resistente bacteriën.
Experimenteel, was een van de eerste opvallende resultaten de waarneming van intracellulaire groei van M. abscessus in macrofagen evenals wat M. tuberculosis6. M. abscessus verzet zich ook tegen de verzuring van de phagosome, apoptosis en autophagy, drie essentiële mechanismen van de cellulaire weerstand tegen de infectie2. Het is zelfs aangetoond dat M. abscessus is in staat om een directe communicatie tussen de phagosome en het cytosol, een meer voedselrijke omgeving die bacteriële vermenigvuldiging2 gunst misschien. Weinig is bekend over de genomic voordelen die M. abscessus bezit of heeft verkregen om te overleven in een intracellulaire milieu toestaan. Amoeba-coculture is een efficiënte methode waardoor het isolement van vele nieuwe amoeba resistente bacteriën zoals Mycobacterium massiliense7,8. Een mogelijkheid om zich te vermenigvuldigen in amoeben werd waargenomen, in een model van aerosolization van M. abscessus in muizen, die een verhoogde virulentie M. abscessus4kan verlenen. Een hypothese is dat M. abscessus genetische eigenschappen opgetreden binnen deze omgeving om te overleven in fagocytische cellen, die afwijken van andere niet-pathogene RGM had ontwikkeld. Deze acquisities wellicht de mogelijkheid om te verspreiden en de virulentie in de menselijke gastheer gunst.
Dit verslag beschrijft instrumenten en methoden om te benadrukken de genomic voordelen aan M. abscessus te overleven in de omgeving van de amoeben verleende uitvoeringsbevoegdheden betreft. Voor dit doel, de screening van M. abscessus transposon mutanten is voor het eerst beschreven, op de Acanthamoeba castellanii type stam, die het mogelijk de identificatie van de mutant defect intracellulaire groeimogelijkheden maakt. Een tweede screening in macrofagen is ook gemeld, om te bevestigen als dit gebrek de menselijke gastheer blijft. Ten tweede, om te begrijpen welke mechanismen worden ingezet in de M. abscessus aan te passen aan het leven in fagocytische cellen en verhoging van de virulentie van de dierlijke ontvangst, een methode die specifiek aangepast voor M. abscessus werd ontwikkeld, na co cultuur in aanwezigheid van de amoeben waardoor de extractie van totaal RNA van intra-amoebal bacteriën. Dientengevolge, werd een uitgebreid overzicht van M. abscessus genen die vereist voor een intracellulair leven zijn ontwikkeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gedrag van de M. abscessus is veel meer vergelijkbaar met het gedrag van pathogene SGM zoals M. tuberculosis dan elke andere mycobacteriën behorend tot RGM2. Het belangrijkste element in de pathogeniteit van SGM is hun vermogen om te overleven of zelfs binnen antigeen-presenteren cellen, zoals macrofagen en dendritische cellen vermenigvuldigen.
M. abscessus heeft bepaalde genomic voordelen verworven, zoals blijkt uit de totale sequentie v…
Acknowledgements
Wij erkennen sterk Pr. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) voor het kostbare geschenk van de mutant bibliotheek en Dr. Ben Marshall (faculteit geneeskunde, Universiteit van Southampton, UK) voor de correcties van het manuscript. Wij erkennen sterk de Franse patiënt vereniging voor Cystic Fibrosis “Vaincre la Mucoviscidose” en “L’Association Gregory Lemarchal” voor hun financiële steun (RF20150501377). Wij danken ook het Nationaal Agentschap voor onderzoek (ANR programma DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)), en de Région Ile-de-France (Domaine d’Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) voor de financiering van de postdoctorale fellowship tot V.L-M. L. L. is een doctoraal fellow van de “Ministère de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
Riferimenti
- Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
- Roux, A. -. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
- Bakala N’Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
- Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
- Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of “Mycobacterium massiliense” sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
- Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
- Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
- Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
- Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii – Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
- Thomas, V., Loret, J. -. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
- Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
- Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
- Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, 246-258 (2011).
- Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
- Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
- Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
- Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
- Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
- Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
- Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
- Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
- Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
- Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).
